內(nèi)皮祖細胞和大鼠腦創(chuàng)傷后損傷組織再生修復(fù)關(guān)系的實驗研究.pdf

1、背景：早在1997年，Asahara等第一次報道了內(nèi)皮祖細胞（EPCs）參與動物缺血組織中的血管新生；EPCs屬于造血干細胞的一個亞群，可以在體內(nèi)外分化為成熟的內(nèi)皮細胞，并參與血管的新生，EPCs在血管新生、傷口愈合、缺血損傷、腫瘤生長等生理和病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。循環(huán)血EPCs歸巢到血管新生部位并在原位分化為內(nèi)皮細胞，這個過程稱之為出生后的血管發(fā)生。骨髓起源的CD34+細胞包含內(nèi)皮祖細胞（EPCs）、內(nèi)皮細胞（EC）以及造血干細胞，

2、CD34+細胞作為內(nèi)皮祖細胞和內(nèi)皮細胞的來源參與組織損傷的血管新生，實驗證實移植CD34+細胞改善缺血性心臟病心肌功能并增加心肌血管新生，同時CD34+細胞可以歸巢到卒中腦組織區(qū)域，可是關(guān)于腦創(chuàng)傷后CD34+細胞的變化及與創(chuàng)傷腦組織修復(fù)的關(guān)系卻暫無報道。最近的報道提示：EPCs被移植到實驗動物的下肢和心臟缺血模型后具有相應(yīng)的治療效果，這為EPCs的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
　　 目的：
　　 1.大鼠外周血中內(nèi)皮祖細胞的分離

3、、培養(yǎng)、擴增和鑒定；2.觀察腦創(chuàng)傷后大鼠外周血CD34+細胞動員與創(chuàng)傷區(qū)腦組織血管新生和修復(fù)的關(guān)系。3.探討大鼠腦創(chuàng)傷后損傷組織中血管新生與神經(jīng)新生的相關(guān)性。
　　 方法：
　　 1.采集大鼠外周靜脈血，采用密度梯度離心法分離外周血中的單個核細胞（MNCs），在包被人纖維連接蛋白（hFN）的培養(yǎng)皿內(nèi)接種至EGM-2培養(yǎng)基，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；培養(yǎng)2天后經(jīng)換液去除未貼壁細胞，以后每3天換液1次，倒置相差熒

4、光顯微鏡下動態(tài)觀察培養(yǎng)細胞的形態(tài)變化特征。借助免疫熒光技術(shù)檢測培養(yǎng)細胞CD34、CD133、Ⅷ因子（vWF）等內(nèi)皮祖細胞系列標志的表達；并通過硫氰酸熒光素標記的乙酰化低密度脂蛋白（DiI-ac-LDL）攝取試驗和荊豆凝集素（FITC-LJEA-1）結(jié)合實驗，進行內(nèi)皮祖細胞功能鑒定。體外培養(yǎng)至第7天，采用流式細胞儀檢測CD34+CD133X2熒光標記陽性細胞所占比率和CD34單熒光標記陽性細胞所占比率。2.本部分取雄性Wistar大鼠98

5、只，隨機分為創(chuàng)傷組和假手術(shù)組，每組49只，各組分為7個亞組（每組7只），大鼠制作液壓腦創(chuàng)傷模型成功后，各將一個亞組分別于傷前、傷后24,48，72，120，and168小時，取外周血測CD34+陽性細胞數(shù)。創(chuàng)傷組和假手術(shù)組分別于術(shù)前和術(shù)后1,3，7，14，21天處死一個亞組（7只），取腦行CD34免疫組化染色，研究血管新生，進一步探索內(nèi)皮祖細胞和新生血管的關(guān)系。3.本部分取雄性Wistar大鼠42只，隨機分為假手術(shù)組和創(chuàng)傷組各21只，創(chuàng)

6、傷后3、7天14天假手術(shù)組和創(chuàng)傷組分別隨機抽取7只大鼠，處死后取腦行腦組織切片免疫組化染色檢測齒狀回Brdu+細胞和Brdu/Neun+細胞數(shù)：取實驗第二部分大鼠腦切片行免疫組化染色檢測CD34和CD31陽性細胞數(shù)，探討大鼠實驗性腦創(chuàng)傷后血管新生和神經(jīng)新生的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：
　　 1.內(nèi)皮祖細胞經(jīng)體外培養(yǎng)第2天細胞貼壁，第五天形成出現(xiàn)細胞克隆樣集落，集落周圍有內(nèi)皮樣細胞，培養(yǎng)細胞表達CD133、CD34、vWF等內(nèi)

7、皮祖細胞標志，表明具有內(nèi)皮祖細胞特征。倒置相差熒光顯微鏡下觀察顯示胞質(zhì)和胞膜呈綠色和紅色雙色熒光，說明內(nèi)皮祖細胞能特異性吸附異DiI-ac-LDL和結(jié)合FITC-UEA-1，具有內(nèi)皮細胞功能。體外培養(yǎng)至第7天，流式細胞儀檢測CD34單熒光標記陽性細胞所占比率為85.4％，CD34+CD133雙熒光標記陽性細胞所占比率為36.5％。2.與假手術(shù)組相比較，大鼠腦創(chuàng)傷后循環(huán)中CD34+細胞數(shù)量顯著增加，大鼠腦創(chuàng)傷區(qū)CD34+細胞顯著增加，傷后

8、創(chuàng)傷區(qū)周圍及傷側(cè)海馬DG各時間點CD34+數(shù)于傷后7天達到峰值，隨后有所下降；創(chuàng)傷區(qū)血管新生顯著增加，循環(huán)CD34+細胞和腦創(chuàng)傷后血管新生密切相關(guān)。3.與假手術(shù)組相比較，腦創(chuàng)傷組傷側(cè)海馬DG各時間點BrdU+細胞、Brdu/Neun+細胞較假手術(shù)組明顯增加；腦創(chuàng)傷后創(chuàng)傷區(qū)及傷側(cè)海馬DG各時間點CD34+、CD31+細胞和MVD均高于假手術(shù)組。相關(guān)分析顯示：血管新生和神經(jīng)新生密切相關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1.可以從大鼠外