脾臟截留循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞及高原環(huán)境對(duì)大鼠顱腦損傷修復(fù)的影響.pdf

1、創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)是全球范圍內(nèi)45歲以下人群致死致殘的首要原因，可以減少傷者的預(yù)期壽命。其中重型TBI患者死亡率高達(dá)35-70％，絕大部分幸存者均遺留不同程度的功能障礙，針對(duì)重型TBI迄今為止仍無有效的治療策略降低死殘率。重型TBI患者的死亡除與年齡大小、原發(fā)損傷嚴(yán)重程度、救治是否及時(shí)等因素有關(guān)外，繼發(fā)性腦損傷所致創(chuàng)傷性腦水腫已成為影響預(yù)后的重要因素。因此，如何有效控制繼發(fā)性腦損傷的進(jìn)展以減輕創(chuàng)傷性腦水腫，對(duì)降低重型TBI死亡率具有

2、重要的臨床價(jià)值及科學(xué)意義。
　　TBI后血管新生是創(chuàng)傷后的一種保護(hù)性機(jī)制，可減輕神經(jīng)組織繼發(fā)性損傷。對(duì)TBI的研究目前主要聚焦于腦保護(hù)及神經(jīng)修復(fù)再生，而對(duì)腦組織缺血區(qū)供血血管關(guān)注甚少。研究證實(shí)在成年人外周血中存在的EPCs能分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，在體內(nèi)具有生成血管的能力，血管新生已成為當(dāng)前再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)，隨著對(duì)EPCs認(rèn)識(shí)的加深，既往認(rèn)為只能靠成熟內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)損傷血管進(jìn)行有限修復(fù)的觀點(diǎn)被顛覆。EPCs在各種因素刺激下可從骨髓及

3、其它組織動(dòng)員到循環(huán)血進(jìn)行損傷的修復(fù)。近年來研究顯示，EPCs是參與生后生理性及病理性血管形成最主要的細(xì)胞，同時(shí)可在體內(nèi)分化為內(nèi)皮細(xì)胞，并參與腦、心、肝、腎等內(nèi)臟器官損傷時(shí)的修復(fù)。因此，EPCs在TBI后修復(fù)中具有重要的治療作用及廣闊的應(yīng)用前景。
　　BBB在維持CNS與血循環(huán)之間的內(nèi)穩(wěn)態(tài)起著重要作用，重型TBI后BBB破壞，繼發(fā)創(chuàng)傷性腦水腫形成是重型TBI患者死亡的首要原因。近來研究認(rèn)為BBB被推薦為TBI一個(gè)有希望的治療靶標(biāo)，穩(wěn)

4、定BBB與神經(jīng)保護(hù)劑兩者結(jié)合可以提高治療成功率。在影響TBI后神經(jīng)功能恢復(fù)及遠(yuǎn)期預(yù)后的諸多因素中，BBB修復(fù)是其中尤為重要的因素;而EPCs可轉(zhuǎn)化為內(nèi)皮細(xì)胞參與血管新生并修復(fù)內(nèi)皮完整性，進(jìn)而防止BBB損傷、加快神經(jīng)功能恢復(fù)。亦有研究表明循環(huán)EPCs水平與TBI臨床嚴(yán)重程度及預(yù)后有關(guān)，可作為TBI預(yù)后的一個(gè)潛在標(biāo)志物。
　　當(dāng)前對(duì)重型TBI的大量研究多關(guān)注腦組織本身，針對(duì)外周免疫反應(yīng)對(duì)TBI的影響缺乏深入研究。近年來研究表明，TBI

5、后繼發(fā)性腦損傷過程中除致傷灶內(nèi)炎癥因子參與外，外周免疫系統(tǒng)亦參與了該過程，促進(jìn)創(chuàng)傷性腦水腫形成，作為人體最主要的免疫器官，脾臟在TBI后腦水腫形成中有重要作用。脾臟亦是機(jī)體最大的淋巴器官，約占體重的0.2％，在清除衰老紅細(xì)胞、產(chǎn)生抗體及誘導(dǎo)免疫方面發(fā)揮重要功能，脾監(jiān)視循環(huán)并清除血中潛在威脅內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的異物。脾臟一直被認(rèn)為是單核細(xì)胞的直接貯庫(kù)，機(jī)體損傷后動(dòng)員大量單核細(xì)胞直接入脾，研究報(bào)道在炎性疾病中脾臟受累及，在脾臟中單核細(xì)胞數(shù)量不僅比循

6、環(huán)中高出數(shù)倍，而且在內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定情況下心肌梗塞后受損心臟單核細(xì)胞數(shù)量亦超出循環(huán)。有研究報(bào)道實(shí)驗(yàn)性卒中導(dǎo)致脾萎縮及脾源性促炎單核巨噬細(xì)胞動(dòng)員進(jìn)入血循環(huán)，進(jìn)而聚集在缺血腦組織，脾尺寸的減少與腦梗塞面積程度呈負(fù)相關(guān)，卒中前2周行脾切除術(shù)具有神經(jīng)保護(hù)作用。
　　課題組前期研究證實(shí)，重型TBI大鼠傷后立即行脾臟切除，能夠有效減輕腦組織水腫程度，顯著降低大鼠死亡率，并能改善其認(rèn)知功能，但具體機(jī)制尚不清楚。既然循環(huán)EPCs水平與TBI臨床嚴(yán)重程度

7、及預(yù)后有關(guān)，而在TBI后行脾切除可以減輕腦水腫，兩者之間是否存在某種重要聯(lián)系？脾切除對(duì)循環(huán)EPCs水平及BBB通透性會(huì)產(chǎn)生什么影響？脾切除是否介導(dǎo)EPCs參與BBB重建？為驗(yàn)證上述疑問，本研究設(shè)計(jì)如下實(shí)驗(yàn)，以明確脾臟在重型TBI后對(duì)循環(huán)EPCs的調(diào)控及其參與BBB修復(fù)的機(jī)制。
　　除了從內(nèi)因方面探討了重型TBI后脾臟對(duì)EPCs的影響及其參與BBB修復(fù)、減輕了創(chuàng)傷性腦水腫，我們還從外因方面初步探討了環(huán)境改變對(duì)重型TBI后創(chuàng)傷性腦水腫

8、的影響，對(duì)常壓、低壓環(huán)境下穿透性腦損傷的傷情進(jìn)行比較，以對(duì)高原條件下創(chuàng)傷性腦水腫的診治提供依據(jù)。
　　研究?jī)?nèi)容:①建立重型TBI大鼠模型，觀察TBI后立即行脾臟切除對(duì)大鼠傷情的影響，主要從血常規(guī)、血糖、死亡率及腦水腫等方面觀察;②對(duì)重型TBI后3天大鼠循環(huán)血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行分離、培養(yǎng)及基本生物學(xué)特性鑒定;③脾切除對(duì)重型TBI大鼠循環(huán)血EPCs及S100B蛋白的影響及兩者間的相互關(guān)系，制模后不同時(shí)間點(diǎn)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)循環(huán)血EPCs，

9、應(yīng)用ELISA檢測(cè)血漿S100B蛋白表達(dá);④重型TBI大鼠BBB通透性的改變情況以及脾切除后對(duì)BBB通透性的影響;利用攜帶EGFP的慢病毒載體轉(zhuǎn)染EPCs，經(jīng)尾靜脈移植后，觀察EPCs移植后對(duì)創(chuàng)傷性腦水腫的影響及其參與血腦屏障重建的機(jī)制，應(yīng)用免疫熒光了解其歸巢至腦損傷灶情況，Westem blot檢測(cè)GFP及VEGF蛋白的表達(dá);⑤對(duì)模擬高原穿透性顱腦損傷傷情的特點(diǎn)進(jìn)行初步研究，通過建立穿透性腦損傷模型，從死亡率、組織病理改變、腦含水量、

10、EB含量、局部腦血流量、局部腦氧分壓、腦干聽覺誘發(fā)電位等方面比較常壓及低壓環(huán)境對(duì)穿透性腦損傷傷情的影響。
　　本次研究得出如下結(jié)果:①建立了穩(wěn)定的大鼠重型TBI模型;進(jìn)一步印證了重型TBI大鼠傷后行脾切除可有效緩解腦水腫，提高生存率。②應(yīng)用密度梯度離心從循環(huán)血分離獲得的單個(gè)核細(xì)胞中存在EPCs，在內(nèi)皮條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)下可由祖細(xì)胞向成熟細(xì)胞分化;所培養(yǎng)EPCs經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定具有EPCs表型特征，并可攝取DiI-Ac-LDL及結(jié)合

11、FITC-UEA-1;EPCs在Matrigel上能形成小管樣結(jié)構(gòu)。③重型TBI后循環(huán)血EPCs增加，脾切除后循環(huán)血EPCs增加更為顯著;重型TBI后血漿S100B蛋白表達(dá)增加，脾切除可以減少其表達(dá);EPCs與血漿S100B蛋白呈正相關(guān)。④大鼠TBI后BBB通透性增加，脾切除可以改善BBB通透性;TBI后行EPCs移植減輕創(chuàng)傷性腦水腫;EPCs參與了TBI后BBB的重建，VEGF可能是EPCs修復(fù)血腦屏障的分子機(jī)制。⑤高原創(chuàng)傷性腦水腫較

12、常壓傷情重、發(fā)生快，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng);早期持續(xù)的rCBF與PbtO2監(jiān)測(cè)對(duì)高原穿透性腦損傷的診治具有重要價(jià)值。
　　研究結(jié)論:1.重型TBI后BBB通透性升高，脾切除可改善BBB通透性;2.重型TBI后行脾切除可以升高循環(huán)EPCs，提示脾臟對(duì)骨髓來源的EPCs具有截留作用;3.重型TBI后EPCs移植可歸巢到損傷灶參與BBB重建，減輕創(chuàng)傷性腦水腫;4.高原創(chuàng)傷性腦水腫傷情重、發(fā)生快、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，早期持續(xù)的rCBF與PbtO2監(jiān)測(cè)對(duì)指導(dǎo)治