電針及藥物抗抑郁的行為學及表觀遺傳學機制研究.pdf

1、抑郁癥是常見的危害人類身心健康的一類精神疾病。近年來抑郁癥發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。據(jù)世界衛(wèi)生組織預測，到2020年，抑郁癥可能成為僅次于心臟病的嚴重威脅人類健康、增加社會經(jīng)濟負擔的第二大疾病。加強抑郁癥的防治，尋找積極、有效的治療方法，具有非常重要的社會和經(jīng)濟意義。目前針對抑郁癥的臨床治療手段主要是藥物治療。但西藥在治療抑郁癥的過程中存在著療效不全（有效率僅70％左右），毒副反應(yīng)大，起效慢，復發(fā)率高等問題。針刺治療抑郁癥在中國具有悠久的

2、歷史，并且具有安全、有效、簡便、幾乎無毒副作用的優(yōu)點。因此探討抑郁癥發(fā)病機制，深入研究電針及藥物對抑郁癥的治療效果和作用機制具有重要的意義和價值。
　　大多數(shù)學者認為抑郁癥可能是心理社會應(yīng)激、遺傳及各種生物學改變等多種因素交互作用的結(jié)果。但其具體發(fā)病機制尚不明確。重大應(yīng)激性生活事件是導致抑郁癥的重要原因之一;生物學改變方面普遍認同的是抑郁癥的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說，該假說認為抑郁癥與腦內(nèi)的去甲腎上腺素(NE)和5-羥色胺(5-HT)等

3、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其相關(guān)受體的異常有關(guān)。臨床應(yīng)用最廣泛的抗抑郁藥，也大部分是調(diào)節(jié)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量及受體改變的。上述抗抑郁藥物能快速引起腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的變化，但與用藥數(shù)周后才產(chǎn)生臨床療效之間的矛盾，使得抑郁癥的病因?qū)W研究已經(jīng)不僅僅局限于中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)功能的失調(diào)。本實驗室的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠海馬齒狀回神經(jīng)干細胞的增殖顯著減少;而給予傳統(tǒng)三環(huán)類抗抑郁藥氯丙咪嗪或應(yīng)用針刺治療后，海馬內(nèi)神經(jīng)干細胞的增殖情況顯著改善，甚

4、至對神經(jīng)膠質(zhì)細胞的增殖也有顯著的改善。而新近的一些研究已經(jīng)提出重性抑郁障礙可能是遺傳和表觀遺傳共同作用的結(jié)果。因此，現(xiàn)今對抑郁癥的研究已涵蓋神經(jīng)內(nèi)分泌、神經(jīng)免疫、神經(jīng)發(fā)育和表觀遺傳等多個方面，并且都匯聚到與神經(jīng)元相關(guān)的分子以及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導的研究方向。
　　表觀遺傳學(epigenetics)是基于對表觀遺傳修飾(epigenetic modification)的認識而開辟了一個新領(lǐng)域，是研究轉(zhuǎn)錄前基因在染色質(zhì)水平的結(jié)構(gòu)修飾對基因功

5、能的影響，這種修飾可通過細胞分裂和增殖周期進行傳遞。早期的研究發(fā)現(xiàn)給精神病人應(yīng)用L-蛋氨酸，能惡化一部分精神分裂癥病人的精神癥狀，而L-蛋氨酸可以為基因的甲基化提供甲基。近來，較多的實驗研究也顯示，在抑郁癥中某些基因?qū)霈F(xiàn)表達過度升高或降低，可是在抑郁癥基因組研究中，尚未發(fā)現(xiàn)確切的基因變異。這些提示在基因本身之外，可能還有其他的因素如表觀修飾，會引起基因表達的異常。
　　基于以上研究回顧，提示抑郁癥的發(fā)病機制可能與表觀遺傳有千絲

6、萬縷的聯(lián)系，尤其是外界應(yīng)激因素誘發(fā)抑郁癥狀與表觀修飾作用于基因表達，有著相通之處。那么針對抑郁癥治療的各種方法如電針，以及各種抗抑郁藥物，它們治療抑郁癥的機制是否和表觀修飾相關(guān)呢？在電針或抗抑郁藥物治療中有哪些基因發(fā)生了表觀修飾后的表達改變呢？本研究正是從表觀遺傳的角度出發(fā)，探討電針及抗抑郁藥物的作用機制，觀察電針和抗抑郁藥物是否通過表觀修飾的方式參與到抑郁癥的治療過程中。
　　在表觀遺傳學研究中，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA met

7、hytransferase，Dnmt)是非常重要的一種表觀修飾酶。Dnmt3L蛋白是一種與Dnmt3類似的蛋白，雖然沒有單獨的催化活性，但是Dnmt3L蛋白可與Dnmt3a和Dnmt3b結(jié)合，提高他們的催化活性，正向調(diào)節(jié)DNA從頭甲基化(denovo methylation)，因而它是DNA從頭甲基化的調(diào)節(jié)因子。在本研究中Dnmt3L基因是關(guān)注的基因之一。檢測抑郁動物以及藥物治療后動物海馬腦區(qū)中Dnmt3L基因的表達及Dnmt3L蛋白的

8、含量變化是本研究的目的之一。
　　髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)，是神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘的主要構(gòu)成蛋白之一。MBP蛋白含量的變化往往作為評判腦損傷的信號之一。近來的一些研究發(fā)現(xiàn)，癲癇發(fā)作后中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘變化與血清和腦脊液中MBP蛋白的變化都是相關(guān)的。早在1986年，就有研究發(fā)現(xiàn)精神分裂患者血清中MBP蛋白含量明顯升高。而抑郁癥患者腦內(nèi)也發(fā)生器質(zhì)性改變，抑郁癥患者腦內(nèi)MBP蛋白含量是否有變化尚未見報道。

9、因此，從表觀遺傳學角度觀察抑郁大鼠海馬內(nèi)MBP基因的表達變化也是本研究的重要目的之一。
　　總之，本研究通過電針“百會”“陽陵泉”以及腹腔注射依他普侖或氯丙咪嗪這些干預手段，在抑郁癥的亞急性和慢性動物模型上用行為學方法評價其抗抑郁效果;然后從表觀修飾的角度，尤其是在甲基化修飾方面觀察電針及藥物是否引起Dnmt3L和MBP基因的修飾改變，從而對抑郁癥的發(fā)病機制以及電針和藥物治療機制進行探討。
　　本研究分為兩個部分。第一部分:

10、電針及藥物對獲得性無助(LearnedHelplessness)大鼠的抗抑郁作用和表觀遺傳學機制研究。(1)復制LearnedHelplessness大鼠抑郁模型，并確定檢測參數(shù)。(2)使用輻射熱測痛儀測定熱刺激反應(yīng)閾值，應(yīng)用von Frey細絲測定機械刺激反應(yīng)閾值，并通過實驗性痛刺激反應(yīng)閾值的測定評價Learned Helpless大鼠抑郁模型。(3)應(yīng)用穿梭箱實驗、強迫游泳實驗、敞箱實驗和高架十字迷宮實驗，從行為學角度，觀測電針、依

11、他普侖和氯丙咪嗪的抗抑郁效果。(4)應(yīng)用全基因組CpG島甲基化芯片，利用差異甲基化雜交技術(shù)對正常大鼠海馬及Helpless大鼠海馬進行基因組CpG島區(qū)域甲基化分析，篩選可能與抑郁癥發(fā)生有關(guān)的甲基化差異基因:Dnmt3L和MBP。(5)應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR和Real-Time PCR技術(shù)檢測正常大鼠、Helpless大鼠、依他普侖與氯丙咪嗪治療組大鼠海馬中Dnmt3L和MBP的mRNA水平。(6)應(yīng)用Western blot檢測helples

12、s大鼠及各治療組的大鼠海馬Dnmt3L和MBP蛋白水平變化。
　　第二部分:電針對慢性不可預知刺激(chronic unpredictable stress，CUS)抑郁大鼠模型的抗抑郁作用及表觀遺傳學機制初探。(1)復制CUS大鼠抑郁模型。(2)應(yīng)用強迫游泳實驗、敞箱實驗和高架十字迷宮實驗，從行為學角度，觀測電針的抗抑郁效果。(3) Real-Time PCR技術(shù)檢測電針治療后各組大鼠海馬中Dnmt3L和MBP的mRNA水平變化

13、。
　　實驗結(jié)果如下:
　　1.電針及藥物對Learned Helplessness大鼠抗抑郁作用和表觀遺傳學機制研究
　　1.1 Learned Helpless大鼠抑郁模型的建立和評價
　　20只Wistar大鼠，在經(jīng)過不可逃避足底電擊后的1、2、3天，對可逃避的足底電擊的逃避失敗次數(shù)逐漸增加，但是在不可逃避足底電擊后的第4和第5天逃避失敗次數(shù)趨于穩(wěn)定，兩者間無顯著性差異，但都顯著高于不可逃避足底電擊后的第1

14、、2天的逃避失敗次數(shù)。表明經(jīng)過不可逃避足底電擊的大鼠，在電擊后第3天開始表現(xiàn)出穩(wěn)定的無助行為。
　　觀察10只Helpless抑郁大鼠，在不可逃避足底電擊后的第3、4、5、6、7天連續(xù)進行穿梭回避反應(yīng)測試。結(jié)果顯示，不可逃避足底電擊后的第3、4、5天，100％大鼠保持Helplessness行為;第6天，還有90％的大鼠保持Helplessness行為;第7天，只有70％的大鼠保持Helplessness行為。表明Learned

15、Helplessness模型大鼠在造模后一周，仍有70％的大鼠可保持抑郁樣行為。
　　1.2 Learned Helpless大鼠的實驗性痛刺激反應(yīng)閾值
　　分別在不可逃避足底電擊前和電擊后第1、3、5、7天五個時間點，觀察正常組，Helplessness和Non-helplessness三組大鼠的機械性刺激反應(yīng)閾值和熱刺激反應(yīng)閾值。結(jié)果顯示，Helpless大鼠左腳和右腳的機械性刺激反應(yīng)閾值，從造模后的第1天到第7天均顯著

16、高于正常組。與Non-helpless大鼠相比，Helpless大鼠左腳和右腳的機械性刺激反應(yīng)閾值，從造模后的第3、5、7天均顯著增高。Non-helpless大鼠左腳和右腳的機械性刺激反應(yīng)閾值基本與正常組無差異。在熱刺激反應(yīng)閾值方面，測定結(jié)果與機械性刺激反應(yīng)閾值變化相同。
　　在給予氯丙咪嗪(Clomipramine)治療后，正常組、Non-helpless和氯丙咪嗪治療組大鼠左腳和右腳的機械性刺激反應(yīng)閾值，均顯著低于Helpl

17、ess組大鼠。然而氯丙咪嗪治療組大鼠的熱刺激反應(yīng)閾值，與Helpless組大鼠相比無顯著性改變。也即，氯丙咪嗪可改善Helpless大鼠的機械性刺激反應(yīng)閾值，但對熱刺激反應(yīng)閾值無明顯影響。
　　1.3電針和抗抑郁藥物對Learned Helplessness大鼠抗抑郁作用的行為學觀察
　　1.3.1電針抗抑郁作用的行為學觀察
　　從基因純合性和表型一致性的角度考慮，分別在近交系Wistar大鼠和封閉群SD大鼠兩個品系動

18、物模型上給予電針干預治療，大鼠均分為五組:正常組(Normal)，模型組(Model)，抑郁模型+假電針組(Sham EA)，抑郁模型+電針組(EA)，抑郁模型+氯丙咪嗪組(Clomipramine)。
　　1.3.1.1穿梭箱實驗
　　經(jīng)過電針治療的Wistar和SD大鼠，在可逃避足底電擊刺激的穿梭箱檢測中，均顯示出穿梭失敗次數(shù)與模型組無明顯差異，但是經(jīng)氯丙咪嗪治療的大鼠穿梭失敗次數(shù)顯著低于模型組。反映出電針對Helple

19、ss大鼠的穿梭回避反應(yīng)能力改善不明顯。
　　1.3.1.2強迫游泳實驗
　　SD大鼠經(jīng)過電針或氯丙咪嗪治療后，在強迫游泳實驗中掙扎時間顯著高于模型組。反映出電針可改善Helpless大鼠的絕望行為。
　　1.3.1.3敞箱實驗
　　在敞箱實驗中，經(jīng)過電針或氯丙咪嗪治療的Wistar大鼠，與模型大鼠相比，在水平方向的總位移顯著增高，直立次數(shù)也明顯增多。反映出電針可顯著改善Helpless大鼠的自發(fā)行為和探究行為。<

20、br>　　1.3.1.4高架十字迷宮實驗
　　在高架十字迷宮實驗中，經(jīng)過電針或氯丙咪嗪治療的Wistar和SD大鼠，開臂滯留時間百分比均顯著高于抑郁模型組。反映出電針可顯著改善Helpless大鼠的焦慮行為。
　　1.3.2依他普侖及氯丙咪嗪抗抑郁作用的行為學觀察
　　仍然從基因純合性和表型一致性的角度考慮，分別在近交系Wistar大鼠和封閉群SD大鼠兩個品系動物模型上分別給予依他普侖腹腔注射治療，大鼠均分為五組:正常

21、組(Normal)，模型組(Model)，抑郁模型+生理鹽水組(Saline)，抑郁模型+依他普侖組(Escitalopram)，抑郁模型+氯丙咪嗪組(Clomipramine)。
　　1.3.2.1穿梭箱實驗
　　經(jīng)過依他普侖治療的Wistar和SD大鼠，在可逃避足底電擊刺激的穿梭箱檢測中，穿梭失敗次數(shù)均顯著低于模型組，這一結(jié)果與氯丙咪嗪治療組完全相似。這反映出依他普侖和氯丙咪嗪均可顯著改善Helpless大鼠的穿梭回避反

22、應(yīng)能力。
　　1.3.2.2強迫游泳實驗
　　SD大鼠經(jīng)過依他普侖或氯丙咪嗪治療后，在強迫游泳實驗中掙扎時間顯著高于模型組。這反映出依他普侖和氯丙咪嗪均可顯著改善Helpless大鼠的絕望行為。
　　1.3.2.3敞箱實驗
　　在敞箱實驗中，與模型組大鼠相比，經(jīng)過依他普侖或氯丙咪嗪治療的Wistar和SD大鼠，在水平方向的總位移都顯著升高，在垂直方向的直立次數(shù)也顯著增多。這反映出依他普侖和氯丙咪嗪均可顯著改善He

23、lpless大鼠的自發(fā)行為和探究行為。
　　1.3.2.4高架十字迷宮實驗
　　在高架十字迷宮實驗中，經(jīng)過依他普侖或氯丙咪嗪治療的Wistar和SD大鼠，開臂滯留時間百分比均顯著高于抑郁模型組大鼠。這反映出依他普侖和氯丙咪嗪均可顯著改善Helpless大鼠的焦慮行為。
　　1.4通過全基因組CpG島甲基化芯片篩查差異甲基化基因
　　利用差異甲基化雜交技術(shù)對正常大鼠海馬及Helpless大鼠海馬進行基因組CpG島區(qū)

24、域甲基化分析，篩選與抑郁癥發(fā)生有關(guān)的甲基化差異基因，在通過基因功能分類和功能分析，依log-Ratio值大于0.5為差異顯著性標準選出Dnmt3L和MBP兩個與抑郁癥發(fā)病有可能相關(guān)的基因。對這兩個基因的啟動子區(qū)域亞硫酸鹽修飾后的甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(Methylation Specific Polymerase chainreaction，MSP)產(chǎn)物序列的測序工作還在進行當中，在此未能給出詳細的基因甲基化位點和甲基化程度。

25、　　1.5逆轉(zhuǎn)錄PCR和Real-Time PCR檢測結(jié)果
　　應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR和Real-Time PCR技術(shù)檢測正常大鼠、Helpless大鼠、生理鹽水組、依他普侖、氯丙咪嗪治療組大鼠海馬中Dnmt3L基因和MBP基因的mRNA變化。Helpless大鼠海馬MBP基因的mRNA水平顯著高于正常組，而依他普侖和氯丙咪嗪治療后大鼠海馬MBP基因的mRNA水平顯著低于模型組，同時也低于正常組。
　　Helpless大鼠和生理鹽

26、水組大鼠的海馬Dnmt3L基因的mRNA水平顯著低于正常組，而依他普侖和氯丙咪嗪治療后大鼠海馬的Dnmt3L基因的mRNA水平顯著高于模型組。
　　1.6 Western Blot檢測結(jié)果
　　應(yīng)用Western Blot方法檢測正常大鼠、Helpless大鼠、生理鹽水組、依他普侖、氯丙咪嗪治療組大鼠海馬中Dnmt3L和MBP的蛋白變化。
　　Helpless大鼠和生理鹽水組大鼠海馬中MBP蛋白含量顯著高于正常組、依他

27、普侖和氯丙咪嗪治療組大鼠。
　　Helpless大鼠和生理鹽水組大鼠的海馬Dnmt3L蛋白含量顯著低于正常組、依他普侖和氯丙咪嗪治療組大鼠，依他普侖治療組大鼠海馬中Dnmt3L蛋白含量顯著高于正常組。
　　1.7小結(jié)
　　上述實驗結(jié)果顯示，實驗大鼠經(jīng)不可逃避足底電擊后第3天開始表現(xiàn)出穩(wěn)定的Helpless行為，而且有70％的模型大鼠可以保持這種行為一周時間。
　?、貶elpless大鼠的機械性刺激反應(yīng)閾值和熱刺激

28、反應(yīng)閾值較正常組或Non-helpless組均有所增高，給予氯丙咪嗪后可降低Helpless大鼠的機械性刺激反應(yīng)閾值，但對于熱刺激反應(yīng)閾值無明顯影響。
　?、谠贚earned Helplessness大鼠抑郁模型上，給予電針治療可以改善抑郁大鼠的探究行為、絕望行為、焦慮行為和自發(fā)行為，但是對可逃避足底電擊的回避行為沒有改善。
　　③給予依他普侖藥物治療后，能夠?qū)Υ┧蠡乇芊磻?yīng)、探究行為、絕望行為、焦慮行為和自發(fā)行為均有所改善，

29、并和氯丙咪嗪治療效果相當。
　?、苄酒瑱z測結(jié)果表明，Helpless大鼠與正常大鼠相比較而言，他們的大腦海馬中存在基因的CpG島區(qū)域甲基化差異。根據(jù)差異程度及基因功能，在這些基因中篩選出Dnmt3L和MBP兩個與抑郁癥發(fā)病有可能相關(guān)的基因。
　?、萃ㄟ^檢測發(fā)現(xiàn)Helpless大鼠海馬的Dnmt3L基因mRNA水平顯著降低，在應(yīng)用依他普侖或氯丙咪嗪后可以逆轉(zhuǎn)。同樣也發(fā)現(xiàn)Helpless大鼠海馬的MBP基因mRNA水平顯著升高，

30、給予依他普侖或氯丙咪嗪后也可以逆轉(zhuǎn)。
　?、尥ㄟ^蛋白檢測，發(fā)現(xiàn)Helpless大鼠和生理鹽水組大鼠海馬MBP蛋白含量顯著升高，Dnmt3L蛋白含量顯著降低。此外，依他普侖治療組大鼠海馬的Dnmt3L蛋白含量顯著高于正常組。
　　2.電針對CUS模型大鼠的抗抑郁作用及表觀遺傳學機制初探
　　2.1 CUS大鼠抑郁模型的復制
　　主要采用6種應(yīng)激方法隨機在9周內(nèi)應(yīng)用，制備慢性不可預知性應(yīng)激刺激大鼠抑郁模型，在該慢性動

31、物模型上給予電針干預治療。大鼠均分為五組:正常組(Normal)，抑郁模型組(Model)，抑郁模型+假電針組(Sham EA)，抑郁模型+電針組(EA)，抑郁模型+氯丙咪嗪組(Clomipramine)。
　　2.2電針對CUS大鼠抗抑郁作用的行為學觀察
　　2.2.1強迫游泳實驗
　　SD抑郁大鼠經(jīng)過電針治療后，在強迫游泳實驗中掙扎時間顯著高于模型組，經(jīng)氯丙咪嗪治療的大鼠也表現(xiàn)出同樣的結(jié)果，但是電針治療組與氯丙咪嗪

32、治療組之間無顯著性差異。這反映出電針可明顯改善CUS大鼠的絕望行為。
　　2.2.2敞箱實驗
　　在敞箱實驗中，經(jīng)過電針和氯丙咪嗪治療的抑郁大鼠，在水平方向的總位移都顯著高于模型組大鼠，而且電針組的水平總位移也顯著高于氯丙咪嗪組。在垂直運動方面，經(jīng)過電針和氯丙咪嗪治療后的大鼠直立次數(shù)均顯著多于模型組。這反映出電針可明顯改善CUS大鼠的自發(fā)行為和探究行為。
　　2.2.3高架十字迷宮實驗
　　在高架十字迷宮實驗中，

33、經(jīng)過電針和氯丙咪嗪治療的SD抑郁大鼠，開臂滯留時間百分比均顯著高于模型組。這反映出電針可明顯改善CUS大鼠的焦慮行為。
　　2.3電針治療后大鼠海馬中Dnmt3L基因和MBP基因的mRNA變化
　　通過Real-Time PCR方法檢測出CUS抑郁模型+假電針組大鼠海馬MBP基因的mRNA水平顯著高于正常組，而電針和氯丙咪嗪治療后大鼠海馬的MBP基因的mRNA水平顯著低于假電針組。CUS抑郁模型+假電針組大鼠海馬Dnmt3L

34、基因的mRNA水平顯著低于正常組，而電針和氯丙咪嗪治療后大鼠海馬的Dnmt3L基因的mRNA水平顯著高于假電針組。
　　2.4小結(jié)
　　上述實驗結(jié)果顯示:
　?、僭贑US大鼠抑郁模型中，給予電針治療可以明顯改善抑郁大鼠的探究行為、絕望行為、焦慮行為和自發(fā)行為。而且電針治療組與氯丙咪嗪治療組在掙扎時間、直立次數(shù)以及開臂滯留時間百分比等方面也無明顯差異，僅在水平總位移中電針治療組顯著優(yōu)于氯丙咪嗪組。
　?、谕ㄟ^檢測發(fā)

35、現(xiàn)CUS抑郁大鼠海馬Dnmt3L基因的mRNA水平顯著降低，在應(yīng)用電針或氯丙咪嗪治療后則升高。
　　③同樣發(fā)現(xiàn)CUS抑郁大鼠海馬MBP基因的mRNA水平顯著升高，給予電針或氯丙咪嗪治療后則降低。
　　綜上所述，本研究可獲得以下結(jié)論:
　　1.Helpless抑郁大鼠的機械性刺激反應(yīng)閾值和熱刺激反應(yīng)閾值會升高，而氯丙咪嗪可逆轉(zhuǎn)機械性刺激反應(yīng)閾值的升高，卻不能逆轉(zhuǎn)熱刺激反應(yīng)閾值的升高。
　　2.在Learned He

36、lplessness大鼠抑郁模型上，電針、依他普侖和氯丙咪嗪均有抗抑郁作用。依他普侖能夠?qū)Υ┧蠡乇芊磻?yīng)、探究行為、絕望行為、焦慮行為和自發(fā)行為均有所改善，氯丙咪嗪治療效果與之相當。電針僅在穿梭回避反應(yīng)方面沒有明顯效果。
　　3.Lenrned Helplessness大鼠抑郁發(fā)生過程及藥物治療中可能與Dnmt3L基因和MBP基因表觀調(diào)節(jié)相關(guān)。
　　4.在CUS抑郁大鼠抑郁模型上，電針和氯丙咪嗪均可以改善CUS抑郁動物模型的抑