尼古丁對(duì)雄性小鼠生殖能力的影響及其誘發(fā)的神經(jīng)行為學(xué)效應(yīng)跨世代傳遞的表觀遺傳學(xué)研究.pdf

1、吸煙是世界上最大也是最受關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。諸多研究均已經(jīng)顯示，吸煙等不良生活習(xí)慣會(huì)對(duì)男性的生育力產(chǎn)生負(fù)面影響，甚至進(jìn)一步影響下一代的健康。目前，這一現(xiàn)象背后的具體分子機(jī)制卻還不甚清楚。為了進(jìn)一步觀察吸煙對(duì)男性生育力的影響并揭示其內(nèi)在的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)建立了一個(gè)模擬人類重度吸煙的小鼠模型。通過(guò)該動(dòng)物模型，我們觀察到了吸煙可以直接引發(fā)小鼠的精子質(zhì)量下降并進(jìn)一步造成其后代的出生率下降。此外，我們前期的工作利用經(jīng)典的蛋白質(zhì)組學(xué)的

2、分析手段探究吸煙對(duì)小鼠睪丸、附睪及成熟精子中蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響，從而揭示了吸煙影響男性生殖能力的部分內(nèi)在分子機(jī)制。鑒于煙草中有害物質(zhì)的多樣性，本研究單獨(dú)研究煙草中的主要毒性物質(zhì)尼古丁對(duì)男性生殖系統(tǒng)的毒理作用，同時(shí)我們也觀察了尼古丁通過(guò)改變影響精子中的表觀遺傳學(xué)修飾進(jìn)而對(duì)后代的健康造成的影響。
　　首先，我們構(gòu)建了一個(gè)尼古丁處理小鼠模型以模擬重度吸煙人群每日接觸的劑量。將6周齡的雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為尼古丁處理組和對(duì)照組。

3、尼古丁處理組以0.2 mg/100 g/日的劑量接受尼古丁腹腔注射，每天注射4次（白天每隔4小時(shí)一次），每次0.05 mg/100 g的尼古丁處理以避免小鼠出現(xiàn)抽搐等不適現(xiàn)象。對(duì)照組(F0-con)則以等量的生理鹽水處理，持續(xù)處理5周。
　　隨后，通過(guò)總蛋白雙向凝膠電泳與質(zhì)譜鑒定聯(lián)用的方法，鑒定出了尼古丁處理小鼠睪丸及附睪組織中的蛋白質(zhì)表達(dá)譜差異。在睪丸組織中，尼古丁處理造成19種蛋白在處理組及對(duì)照組小鼠之間顯著差異表達(dá)，而其中的

4、17種被成功的鑒定出來(lái)。后續(xù)的生物信息學(xué)分析如GO分析及IPA通路分析，提示了這些被鑒定的差異表達(dá)蛋白大部分都與細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性有關(guān)，因?yàn)槠渲饕杏谂c細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)信號(hào)通路和細(xì)胞能量代謝調(diào)節(jié)過(guò)程中。為了進(jìn)一步研究尼古丁暴露對(duì)小鼠精子運(yùn)動(dòng)能力的真實(shí)影響，我們利用計(jì)算機(jī)輔助精子分析（CASA）技術(shù)觀察了小鼠精子的運(yùn)動(dòng)性指標(biāo)。結(jié)果顯示，多種精子運(yùn)動(dòng)性指標(biāo)都在尼古丁處理小鼠精子中出現(xiàn)了顯著上調(diào)。這顯示了尼古丁暴露顯著提升了小鼠精子的運(yùn)動(dòng)性能，同時(shí)可

5、能抑制了其能量代謝過(guò)程。此外我們還觀察到一種細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白PFN1在尼古丁處理小鼠生精細(xì)胞中發(fā)生高表達(dá)，而其高表達(dá)是由于其編碼基因Pfn1啟動(dòng)子區(qū)域的低甲基化造成的。表達(dá)上調(diào)的PFN1通過(guò)提升生精細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白的周轉(zhuǎn)效率從而最終造成小鼠成熟精子運(yùn)動(dòng)能力的提升。尼古丁促進(jìn)小鼠精子的運(yùn)動(dòng)性并抑制其能量代謝過(guò)程，這一現(xiàn)象可能最終影響精子的受精過(guò)程，并對(duì)后代的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生一定的影響。
　　在附睪組織中，蛋白組學(xué)分析鑒定出了15種在尼古丁

6、處理和對(duì)照組之間差異表達(dá)的蛋白。隨后的生物信息學(xué)分析顯示這些差異表達(dá)蛋白主要集中于與分子轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程及多元醇途徑中。這顯示了尼古丁可能削弱了附睪的分泌功能并最終影響精子的成熟進(jìn)程。通過(guò)免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)，尼古丁暴露可以顯著降低小鼠附睪管腔中的附睪小體分布，這一現(xiàn)象從另外一個(gè)角度印證了尼古丁對(duì)附睪分泌功能的損傷。此外，我們通過(guò)觀察小鼠精子體外獲能后蛋白酪氨酸磷酸化的水平發(fā)現(xiàn)，尼古丁處理組小鼠精子的體外獲能過(guò)程受到干擾，并且其精液中果糖濃度也顯著

7、較低。我們的研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生果糖的多元醇通路中重要的組分山梨醇脫氫酶的編碼基因Sord是一個(gè)受啟動(dòng)子DNA甲基化水平調(diào)控的基因。在小鼠附睪尾部組織中，尼古丁造成Sord基因啟動(dòng)子特定區(qū)域DNA高甲基化，并降低SORD的表達(dá)水平，最終造成小鼠精子成熟過(guò)程中重要的能量物質(zhì)果糖的缺乏從而影響精子的體外獲能過(guò)程。附睪分子轉(zhuǎn)運(yùn)功能下降和SORD的低表達(dá)可能是尼古丁對(duì)附睪組織毒理學(xué)作用的分子基礎(chǔ)。
　　理論上，尼古丁在小鼠生精過(guò)程中造成的DNA甲

8、基化水平的改變可以通過(guò)受精作用傳遞到下一代，并影響其胚胎的發(fā)育過(guò)程并造成一定的表型。為了觀察尼古丁引發(fā)的神經(jīng)精神病學(xué)效應(yīng)通過(guò)父系表觀遺傳學(xué)信息實(shí)現(xiàn)跨世代傳遞的現(xiàn)象，我們采用了多種動(dòng)物行為學(xué)的實(shí)驗(yàn)手段觀察了吸煙和尼古丁處理雄性小鼠（F0）及其雄性后代（F1）的神經(jīng)精神狀態(tài)。動(dòng)物行為學(xué)數(shù)據(jù)顯示，吸煙及尼古丁處理雄性小鼠可以自身產(chǎn)生類似抑郁癥的行為學(xué)表型，卻使其雄性后代（F1）的自發(fā)活動(dòng)性顯著增加，抑郁程度降低。但是這種父系尼古丁處理引發(fā)的動(dòng)

9、物行為學(xué)表型并沒(méi)有通過(guò)表觀遺傳學(xué)信息隨著父系鏈傳遞到F2代小鼠。隨后通過(guò)二代測(cè)序，我們觀察了尼古丁處理小鼠精子中轉(zhuǎn)錄譜學(xué)層面的變化并以此提示我們產(chǎn)生獲得性表型跨世代傳遞的可能機(jī)制。結(jié)果顯示在尼古丁處理小鼠的精子中與Wnt4通路相關(guān)的關(guān)鍵基因的表達(dá)都發(fā)生了明顯變化，這提示了尼古丁可能通過(guò)影響父系Wnt4信號(hào)通路，進(jìn)而影響到子代的精神狀態(tài)。我們后續(xù)的分子生物學(xué)研究還顯示，父系尼古丁處理可引發(fā) F1代小鼠腦組織海馬區(qū)中Wnt4通路的活化，從而

10、促進(jìn)下游的關(guān)鍵蛋白分子GSK-3從非磷酸化向磷酸化狀態(tài)轉(zhuǎn)變。非磷酸化的GSK-3分子具有神經(jīng)毒性，而尼古丁處理緩解了這種毒性作用，從而改變了F1代小鼠的行為學(xué)表型。究其原因，我們發(fā)現(xiàn)調(diào)控 Wnt4表達(dá)水平的一種 miRNA，mmu-miR-15b在尼古丁處理的F0代小鼠睪丸、精子及其F1代小鼠腦組織中均低表達(dá)，這可能是導(dǎo)致 Wnt4通路激活的原因。對(duì)mmu-miR-15b基因的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)可能受到啟動(dòng)子區(qū)域之前的CpG島灘

11、（CpG shore）的DNA甲基化水平調(diào)控。因而，利用表觀遺傳學(xué)的研究手段，現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示尼古丁處理導(dǎo)致小鼠精子中mmu-miR-15b基因CpG島灘區(qū)域高甲基化，從而下調(diào)其表達(dá)水平。而這一表觀遺傳學(xué)信息介導(dǎo)了尼古丁引發(fā)的神經(jīng)精神病學(xué)效應(yīng)的父系跨世代傳遞。當(dāng)將過(guò)表達(dá)WNT4或mmu-miR-15b的慢病毒質(zhì)粒在小鼠特定腦區(qū)中注射后的動(dòng)物行為學(xué)表型實(shí)驗(yàn)，均證明了 Wnt4的上調(diào)確實(shí)可以誘發(fā)小鼠活動(dòng)性增加，抑郁程度減輕。而在父系尼古丁處

12、理的F1代小鼠丘腦中過(guò)表達(dá)mmu-miR-15b則能逆轉(zhuǎn)其行為學(xué)表型，這顯示了尼古丁引發(fā)的動(dòng)物行為學(xué)表型處理確實(shí)是通過(guò)mmu-miR-15b實(shí)現(xiàn)了父系跨世代的遺傳。
　　綜上所述，尼古丁處理可以引發(fā)小鼠精子發(fā)生過(guò)程中一系列的表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象。睪丸組織中，尼古丁造成Pfn1基因啟動(dòng)子區(qū)域低甲基化，從而上調(diào)生精細(xì)胞中細(xì)胞骨架蛋白周轉(zhuǎn)，最終造成小鼠精子運(yùn)動(dòng)能力上升。而在附睪組織中，尼古丁則造成Sord基因啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化，從而抑制多元醇