電針增加Neurogenin2表達(dá)和促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生從而改善全腦缺血后小鼠神經(jīng)行為學(xué)的研究.pdf

1、背景
　　隨著醫(yī)療條件的進(jìn)步,腦中風(fēng)的存活率已經(jīng)有了很大的提高,但是腦中風(fēng)的后遺癥仍然是亟需攻克的難題。目前認(rèn)為中風(fēng)后神經(jīng)系統(tǒng)障礙的主要原因,是沒(méi)有足夠的新生神經(jīng)元來(lái)替代凋亡的神經(jīng)細(xì)胞,并且發(fā)揮功能?，F(xiàn)在的研究揭示在成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的側(cè)腦室外側(cè)壁室下帶(SVZ)和海馬齒狀回(DG)的顆粒下層儲(chǔ)存有神經(jīng)干細(xì)胞,可以在一定的條件下增殖分化成神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞,參與神經(jīng)功能的修復(fù)過(guò)程,稱之為神經(jīng)發(fā)生。
　　針灸在治療中風(fēng)后遺

2、癥方面有顯著的療效和悠遠(yuǎn)的歷史,電針(electroacupuncture,EA)是融合針灸理論和生物學(xué)電刺激的產(chǎn)物,能產(chǎn)生和針刺相同的效應(yīng),無(wú)痛且安全可靠,臨床上已經(jīng)廣泛用于中風(fēng)后的治療,但是具體機(jī)制仍有待發(fā)掘研究。
　　Neurogenin2(Neurog2)是調(diào)節(jié)胚胎期大腦皮質(zhì)神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)元放射狀遷移的關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子。它在神經(jīng)系統(tǒng)不同區(qū)域參與了神經(jīng)元的分化與亞型的決定。Neurog2在成年哺乳動(dòng)物腦缺血后的表達(dá)的研究報(bào)道很

3、少,亦不清楚。
　　本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了動(dòng)物的全腦缺血再灌注(ischemiareperfusion,I/R)模型,觀察早期給予電針治療能否改善缺血后的運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能障礙,并探討了可能的機(jī)制,同時(shí)觀察了缺血后Neurog2表達(dá)動(dòng)態(tài)變化,探索電針治療改善缺血后的運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能障礙是否與增加Neurog2和促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生相關(guān),并為電針治療中風(fēng)以及利用Neurog2蛋白治療腦中風(fēng)提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)一電針能有效改善腦缺血后小鼠的運(yùn)動(dòng)

4、和認(rèn)知功能
　　目的
　　探討電針在成年動(dòng)物腦缺血后的治療的有效性。
　　方法
　　5月齡的C57雄性小鼠,體重超過(guò)20g,根據(jù)SPSS統(tǒng)計(jì)軟件產(chǎn)生隨機(jī)數(shù)字將其隨機(jī)化分成四組:假手術(shù)組(sham組n=6),假手術(shù)組+電針治療組(EA+sham組n=6),全腦缺血組(I/R組n=6),電針+全腦缺血組(EA+I/R組n=6),采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎20min再恢復(fù)血液灌流的方法構(gòu)建全腦缺血模型,給予EA治療的兩組則在

5、構(gòu)建模型成功后連續(xù)5d,每天給予電針刺激百會(huì)穴,其參數(shù)基于本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)成果:時(shí)長(zhǎng)30min、頻率15/2Hz、強(qiáng)度1-2mA。電針治療結(jié)束后,進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分以及水迷宮測(cè)試。
　　結(jié)果
　　1)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分:與sham組相比,EA+sham組的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分較優(yōu)于對(duì)照組,但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而缺血兩組相比,EA+I/R組的評(píng)分優(yōu)于I/R組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。缺血兩組的運(yùn)動(dòng)功能明顯的較對(duì)照兩組的差。2)水迷宮測(cè)試:定向航

6、行試驗(yàn),與I/R組相比較,EA+I/R組小鼠的逃避潛伏期明顯縮短,同時(shí)EA+sham組小鼠的逃避潛伏期較sham組為短,但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在實(shí)驗(yàn)的第6天,EA+I/R組小鼠與I/R組相比其在平臺(tái)所在象限游動(dòng)的時(shí)間明顯較長(zhǎng)(*P<0.05),EA+sham組小鼠的目標(biāo)象限時(shí)間與sham組相比也較長(zhǎng)。
　　結(jié)論
　　電針能夠有效的改善全腦缺血后小鼠的運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能,對(duì)于全腦缺血后的癥狀有較好的治療作用。

7、r>　　實(shí)驗(yàn)二電針抑制全腦缺血后小鼠神經(jīng)元凋亡和促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生
　　目的
　　探討電針改善全腦缺血后小鼠的運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能是否與通過(guò)抑制神經(jīng)元凋亡和促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生有關(guān)。
　　方法
　　5月齡成年C57雄性小鼠,采用結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈構(gòu)建全腦缺血模型,隨機(jī)分成四組sham組(n=9),EA+sham組(n=9),I/R(n=9),EA+I/R組(n=9)。EA+sham組和EA+I/R組則在構(gòu)建模型成功后第二天開(kāi)始每天給予

8、電針刺激百會(huì)穴,其參數(shù):時(shí)長(zhǎng)30min、頻率15/2Hz、強(qiáng)度1-2mA。于建模后第二天四組動(dòng)物腹腔注射Brdu,連續(xù)14d,劑量50mg/kg。于注射Brdu結(jié)束后灌注切腦片進(jìn)行神經(jīng)元凋亡TUNEL檢測(cè),尼氏染色和免疫熒光染色。
　　結(jié)果
　　1)神經(jīng)發(fā)生的結(jié)果相較于sham組,缺血兩組的Brdu陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目的表達(dá)增加,電針治療后神經(jīng)發(fā)生的數(shù)目更加明顯,并且與Neurog2有共定位。2)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)EA+I/

9、R組的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)少于單純?nèi)毖M,說(shuō)明電針具有抑制神經(jīng)元凋亡的作用,而兩個(gè)sham組并未檢測(cè)到凋亡的神經(jīng)元。3)尼氏染色結(jié)果提示,缺血兩組小鼠海馬內(nèi)神經(jīng)元排列紊亂,細(xì)胞內(nèi)尼氏小體消失,但是給予電針處理的缺血組的神經(jīng)元損害程度相對(duì)減輕。
　　結(jié)論:電針刺激改善了腦缺血小鼠的神經(jīng)行為學(xué)發(fā)揮腦保護(hù)作用很可能是通過(guò)抑制神經(jīng)元凋亡和促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生這兩點(diǎn)實(shí)現(xiàn)的。
　　實(shí)驗(yàn)三電針促進(jìn)腦缺血后小鼠腦內(nèi)Neurog2表達(dá)研究
　

10、　目的
　　探討腦缺血后成年小鼠腦內(nèi)Neurog2的表達(dá)變化以及電針能否激活神經(jīng)前體基因Neurog2的表達(dá)。
　　方法
　　5月齡的C57雄性小鼠,體重超過(guò)20g,根據(jù)SPSS統(tǒng)計(jì)軟件產(chǎn)生隨機(jī)數(shù)字將其隨機(jī)化分為四組,sham組(n=9),EA+sham組(n=9),I/R組(n=15),EA+I/R組(n=9),采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎20min再恢復(fù)血液灌流的方法構(gòu)建全腦缺血模型。I/R組分別在3d、5d、7d各時(shí)刻分

11、別處死三只實(shí)驗(yàn)小鼠。EA+I/R組和EA+sham組則在構(gòu)建模型成功后連續(xù)5d,每天給予電針刺激百會(huì)穴,其參數(shù)基于本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)成果:時(shí)長(zhǎng)30min、頻率15/2Hz、強(qiáng)度1-2mA。電針治療結(jié)束后,實(shí)行頸椎脫臼法處死小鼠。立刻置冰上取材,完整剝離小鼠雙側(cè)的海馬組織,提取RNA做PCR實(shí)驗(yàn)分析,并灌注取腦進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。
　　結(jié)果
　　1)Neurog2在成年小鼠全腦缺血再灌注損傷后的表達(dá)情況:從檢測(cè)到Neurog2的m

12、RNA水平看來(lái),與假手術(shù)組相比,缺血后3dNeurog2的表達(dá)逐漸增加,5d時(shí)達(dá)到峰值(P<0.01),7d開(kāi)始回落。2)電針治療后Neurog2的表達(dá)變化:當(dāng)給予Sham組加電針治療后,相比單純Sham組Neurog2的水平明顯增加(P<0.01),缺血加電針治療組的mRNA水平也明顯較缺血組增加(P<0.001),而兩個(gè)電針組相比較則缺血加電針組Neurog2的表達(dá)也是高于單純電針組。3)免疫熒光染色可以看到腦缺血后Neurog2表

13、達(dá)增加,并且在電針刺激后表達(dá)明顯增強(qiáng)。
　　結(jié)論:Neurog2在成年動(dòng)物腦缺血再灌注后的表達(dá)會(huì)被激活呈現(xiàn)一個(gè)動(dòng)態(tài)的變化,并且電針可以促進(jìn)Neurog2的表達(dá)增加。
　　實(shí)驗(yàn)四Neurog2腦內(nèi)注射改善神經(jīng)行為學(xué)以及促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的研究
　　目的
　　研究側(cè)腦室注射Neurog2蛋白對(duì)腦缺血小鼠神經(jīng)功能及海馬區(qū)神經(jīng)發(fā)生的影響,探討側(cè)腦室注射Neurog2蛋白的作用。
　　方法
　　將18只C57小鼠隨機(jī)

14、分為3組:假手術(shù)組(sham組)和全腦缺血模型組(I/R組),缺血組加注射Neurog2蛋白組(Neurog2+I/R組),每組6只。第三組于建立模型前1天,單次給予側(cè)腦室注射Neurog2蛋白(10umol/L)4ul。注射完畢后第二天構(gòu)建全腦缺血模型,假手術(shù)組給予類似操作但不結(jié)扎頸總動(dòng)脈,建模后每組小鼠每天連續(xù)注射腹腔注射Brdu7天,觀察給予注射Neurog2后各組小鼠的神經(jīng)行為學(xué)和海馬的神經(jīng)發(fā)生的情況。
　　結(jié)果