針對(duì)NgR1和PirB靶向治療改善小鼠腦缺血后神經(jīng)功能的研究.pdf

1、腦卒中是中國(guó)成年人中致死、致殘的首要病因,同時(shí)也是西方國(guó)家第二大致死病因。不僅如此,腦卒中后的幸存者還相繼發(fā)生了偏癱、失語(yǔ)等后遺癥從而使這些人的生活質(zhì)量嚴(yán)重下降。目前,纖維蛋白溶解療法和抗血小板聚集藥物的應(yīng)用是治療腦卒中最有效的方法。但是這些療法時(shí)間窗狹窄(<4.5h),只有約10％的腦卒中后患者適用于再此療法且不能解決術(shù)后多種后遺癥。至今為止,腦卒中后神經(jīng)功能障礙的有效方法僅有復(fù)健鍛煉,但這種方法所需時(shí)間長(zhǎng)且收效甚微。因此,研制出有效

2、藥物從根本上解決腦卒中后長(zhǎng)期的神經(jīng)功能障礙刻不容緩。
　　Nogo-A蛋白的發(fā)現(xiàn),為治療中風(fēng)后神經(jīng)功能障礙帶來(lái)了希望。Nogo-A有抗CNS損傷后的突觸重建的作用。NgR1是Nogo-A的受體,抑制NgR1能促進(jìn)軸突再生。我們前期研究發(fā)現(xiàn),包含Nogo-A特定功能區(qū)域的TAT-M9蛋白無(wú)論在體內(nèi)還是體外實(shí)驗(yàn)中均能在急性期減少活性氧的生成,抑制細(xì)胞凋亡。同時(shí),NgR1的抗體蛋白TAT-NEP1-40能抑制Nogo-A作用增強(qiáng)大鼠腦缺

3、血后短期的神經(jīng)突觸可塑性和神經(jīng)功能。而最近報(bào)道稱(chēng),腦缺血損傷后28天內(nèi)神經(jīng)元Nogo-A的表達(dá)在腦損傷早期(7d)下降,之后逐漸升高。依據(jù)Nogo-A在腦缺血后的空間表達(dá)特異性,我們擬用TAT-M9進(jìn)行急性期(7d)的抗凋亡治療,Nogo-A表達(dá)高峰時(shí)應(yīng)用TAT-NEP1-40促進(jìn)突觸重建,深入研究聯(lián)合應(yīng)用TAT-M9和TAT-NEP1-40的長(zhǎng)期保護(hù)作用,為缺血性腦卒中提供新的治療方法。
　　PirB也是髓磷脂蛋白的功能性受體。

4、有研究發(fā)現(xiàn),基因敲除PirB后會(huì)引起比敲除NgR1更多的軸突再生。故此,推測(cè)PirB在髓磷脂抑制作用中占有更大的比例,提示PirB也可能成為腦卒中后康復(fù)治療的又一個(gè)作用靶點(diǎn)。為了抑制PirB的作用,我們利用PirB的細(xì)胞外段合成了PEP。然而,PEP的分子量過(guò)大,不能通過(guò)血腦屏障。因此,我們應(yīng)用蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)再一次合成了具有血腦屏障通透性的TAT-PEP融合蛋白。為進(jìn)一步明確PirB對(duì)缺血性腦卒中的治療作用提供了研究基礎(chǔ)。
　　因此

5、,本課題以小鼠全腦缺血(BCCAO)模型和海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22氧糖剝奪(OGD)模型為對(duì)象,應(yīng)用免疫組織化學(xué)、蛋白印記和神經(jīng)行為學(xué)等方法,觀察聯(lián)合應(yīng)用TAT-M9和TAT-NEP1-40及TAT-PEP對(duì)腦缺血損傷后長(zhǎng)期神經(jīng)保護(hù)作用,旨在提供針對(duì)缺血性腦卒中治療新的干預(yù)目標(biāo)和藥物,并且腦卒中后的治療模式提供新思路。
　　實(shí)驗(yàn)一:TAT-M9對(duì)腦缺血損傷急性期的保護(hù)作用
　　目的:對(duì)小鼠全腦缺血7d后TAT-M9腦保護(hù)作用

6、的觀察。
　　方法:采用C57BL/6小鼠,建立BCCAO模型,將小鼠隨機(jī)分為三組: Sham組(假手術(shù)組,n=6),Control組(0.5ml生理鹽水,qd ip,n=6)和TAT-M9組(10mg/kg,qd ip,n=6),再灌注即刻給藥,之后每天同一時(shí)間段行藥物腹腔注射,連續(xù)7d。于首次藥物注射6h后,通過(guò)免疫組化染色觀察藥物通過(guò)血腦屏障情況。于第7d行總體運(yùn)動(dòng)評(píng)分(TMS)觀察BCCAO小鼠術(shù)的自主神經(jīng)運(yùn)動(dòng)能力。應(yīng)用H

7、E染色觀察并計(jì)數(shù)腦缺血7d后神經(jīng)元的存活情況。采用TUNEL染色觀察并計(jì)數(shù)小鼠缺血后7d海馬神經(jīng)元的凋亡情況,通過(guò)western blot明確Bcl-2和Bax在海馬的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:成功建立了BCCAO模型,觀察到TAT-M9可通過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦缺血區(qū),并表達(dá)于海馬神經(jīng)元。TAT-M9治療可改善BCCAO術(shù)7d小鼠的TMS評(píng)分(P<0.01)。TAT-M9治療使BCCAO術(shù)后海馬CA1區(qū)存活神經(jīng)元數(shù)量顯著增加(P<0.01

8、)。TAT-M9治療還可顯著減少BCCAO術(shù)后7d海馬CA1區(qū)TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目(P<0.01),同時(shí)TAT-M9還提高Bcl-2/Bax的相對(duì)值(P<0.01)。
　　結(jié)論:TAT-M9能穿過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦海馬 CA1區(qū)和神經(jīng)元內(nèi),減少腦缺血再灌注損傷急性期(7d)的神經(jīng)元損傷,抑制神經(jīng)凋亡,減少神經(jīng)元丟失,促進(jìn)神經(jīng)元存活,改善小鼠的自主神經(jīng)運(yùn)動(dòng)能力。
　　實(shí)驗(yàn)二:聯(lián)合應(yīng)用TAT-M9與TAT-NEP1-40對(duì)腦缺血

9、損傷的長(zhǎng)期保護(hù)作用
　　目的:觀察聯(lián)合應(yīng)用TAT-M9與TAT-NEP1-40對(duì)小鼠全腦缺血損傷后的長(zhǎng)期神經(jīng)保護(hù)作用
　　方法:采用C57BL/6小鼠,建立BCCAO模型,小鼠隨機(jī)分成四組:Control組(0.5ml生理鹽水,qd ip,n=30),TAT-M9組(10mg/kg,qd ip,n=30),TAT-NEP1-40組(6mg/kg,qd ip,n=30),TAT-M9+TAT-NEP1-40組。TAT-M9組于

10、再灌注即刻給藥,持續(xù)7d;TAT-NEP1-40組于第8d給藥,持續(xù)至28d;TAT-M9+TAT-NEP1-40組于再灌注即刻給予TAT-M9,連續(xù)7d,從第8d給予TAT-NEP1-40,持續(xù)至28d。于BCCAO后28d通過(guò)被動(dòng)回避平臺(tái)實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮和恐懼箱實(shí)驗(yàn)鑒定治療后小鼠的短期記憶能力。應(yīng)用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠自主運(yùn)動(dòng)功能。應(yīng)用Morris水迷宮和T迷宮觀察小鼠長(zhǎng)期記憶能力。通過(guò)免疫熒光染色觀察注射6h后TAT-NEP1-40

11、通過(guò)血腦屏障,及治療28d后缺血區(qū)軸突生長(zhǎng)情況。通過(guò)western blot明確28d后BCCAO小鼠軸突生長(zhǎng)因子(Tau、GAP43和MAP2)表達(dá)量的變化情況。
　　結(jié)果:成功建立了BCCAO模型,觀察到TAT-NEP1-40通過(guò)血腦屏障并表達(dá)于海馬神經(jīng)元。TAT-M9和TAT-NEP1-40聯(lián)合治療能促進(jìn)Tau、GAP43和MAP2的表達(dá)(P<0.01),促進(jìn)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)。TAT-M9和TAT-NEP1-40聯(lián)

12、合治療還能提高BCCAO小鼠28d后短期空間學(xué)習(xí)和記憶能力(P<0.01)及短期的關(guān)聯(lián)性和條件暗示性記憶能力(P<0.05);TAT-M9和TAT-NEP1-40聯(lián)合治療也改善了BCCAO小鼠28d后長(zhǎng)期空間學(xué)習(xí)和記憶能力(P<0.01)以及長(zhǎng)期工作記憶和參考記憶能力(P<0.01)。
　　結(jié)論:長(zhǎng)時(shí)程聯(lián)合應(yīng)用TAT-M9和TAT-NEP1-40能促進(jìn)損傷區(qū)神經(jīng)軸突再生,提高腦缺血損傷后小鼠短期及長(zhǎng)期的空間學(xué)習(xí)記憶能力,促進(jìn)缺血損

13、傷后的神經(jīng)功能恢復(fù)。
　　實(shí)驗(yàn)三:TAT-PEP對(duì)氧糖剝奪HT22細(xì)胞的保護(hù)作用及軸突生長(zhǎng)的影響
　　目的:通過(guò)離體研究,明確TAT-PEP是否能促進(jìn)氧糖剝奪(OGD)的HT22細(xì)胞的軸突再生。
　　方法:采用小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22細(xì)胞,首先應(yīng)用MTT確定TAT-PEP的最佳有效濃度。其次將細(xì)胞分為三組:Sham組、OGD組、OGD+TAT-PEP組,細(xì)胞復(fù)氧后24h后,免疫熒光染色觀察3d后細(xì)胞軸突再生情況。<

14、br>　　結(jié)果:當(dāng)TAT-PEP濃度為150μg/L時(shí),OGD后細(xì)胞存活數(shù)最多。且TAT-PEP顯著促進(jìn)OGD模型24h后的神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)。
　　結(jié)論:TAT-PEP可作用于神經(jīng)元,促進(jìn)神經(jīng)突的再生。
　　實(shí)驗(yàn)四:TAT-PEP長(zhǎng)期治療對(duì)腦缺血損傷保護(hù)與神經(jīng)功能的影響
　　目的:通過(guò)在體實(shí)驗(yàn),明確TAT-PEP對(duì)小鼠全腦缺血后是否具有長(zhǎng)期的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)
　　方法:采用 C57BL/6小鼠,建立 BCCAO模型,將

15、小鼠隨機(jī)分為三組: Sham組(假手術(shù)組,n=40),Control組(0.5ml生理鹽水,qd ip,n=40)和TAT-PEP組(150μg/kg,qd ip,n=40),再灌注即刻給藥,連續(xù)28d。首次藥物注射6h、24h、48h后通過(guò)免疫熒光染色觀察藥物通過(guò)血腦屏障情況。應(yīng)用HE染色和Nissl染色觀察并計(jì)數(shù)BCCAO小鼠7d后神經(jīng)元的存活情況。采用TUNEL染色統(tǒng)計(jì)BCCAO小鼠7d后神經(jīng)元的凋亡情況,應(yīng)用 FJC染色統(tǒng)計(jì) B

16、CCAO小鼠7d后神經(jīng)元變性情況。通過(guò)western blot明確28d后BCCAO小鼠軸突生長(zhǎng)因子(Tau和GAP43)表達(dá)量的變化情況。MAP2免疫熒光檢測(cè)損傷區(qū)軸突再生情況。通過(guò)被動(dòng)回避平臺(tái)試驗(yàn)、高架十字迷宮和恐懼箱實(shí)驗(yàn)鑒定治療后小鼠的短期記憶能力。應(yīng)用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠自主運(yùn)動(dòng)功能。應(yīng)用Morris水迷宮和T迷宮觀察小鼠長(zhǎng)期記憶能力。
　　結(jié)果:成功建立了BCCAO模型,觀察到TAT-PEP通過(guò)血腦屏障表達(dá)于海馬神經(jīng)元,并于

17、24h是表達(dá)量最高。TAT-PEP治療可明顯增加BCCAO術(shù)后7d神經(jīng)元在海馬CA1區(qū)的存活數(shù)量(P<0.01);TAT-PEP治療顯著增加BCCAO術(shù)后7d海馬CA1區(qū)Nissl陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目(P<0.01);TAT-PEP治療可顯著減少BCCAO術(shù)后7d海馬CA1區(qū)TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目(P<0.01);TAT-PEP治療還可顯著減少BCCAO術(shù)后7d海馬CA1區(qū)FJC陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目(P<0.01)。TAT-PEP治療能促進(jìn)Tau

18、(P<0.05)及GAP43(P<0.01)的表達(dá),促進(jìn)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)。TAT-PEP治療還能提高BCCAO小鼠28d后短期空間學(xué)習(xí)記憶能力(P<0.05,P<0.01)及短期的關(guān)聯(lián)性和條件暗示性記憶能力(P<0.05);TAT-PEP治療也改善了BCCAO小鼠28d后長(zhǎng)期空間學(xué)習(xí)記憶能力(P<0.05,P<0.01)以及長(zhǎng)期工作記憶和參考記憶能力(P<0.05,P<0.01)。
　　結(jié)論:TAT-PEP治療能減少腦缺

19、血損傷后短期的神經(jīng)元的變性和凋亡,促進(jìn)神經(jīng)元的存活。促進(jìn)損傷區(qū)神經(jīng)軸突再生,提高腦缺血損傷后小鼠短期和長(zhǎng)期的記憶能力。
　　小結(jié):以上研究證實(shí),TAT-M9、TAT-NEP1-40和TAT-PEP均能通過(guò)BBB,作用于損傷神經(jīng)元;TAT-M9可以減少缺血損傷區(qū)的神經(jīng)元丟失,抑制凋亡,改善缺血急性期的神經(jīng)功能;聯(lián)合應(yīng)用TAT-M9和TAT-NEP1-40治療顯著促進(jìn)軸突再生,對(duì)缺血性損傷后的小鼠的長(zhǎng)期和短期的空間學(xué)習(xí)及記憶能力均明顯