知母皂苷BII的生物轉(zhuǎn)化及其糖基化酶的研究.pdf

1、知母皂苷BII為來源于中藥知母的呋甾皂苷類單體化合物，可以顯著改善多種擬癡呆動物模型的學習記憶功能，其作用機理為上調(diào)膽堿能N&M受體，改善腦缺血及缺血損傷。現(xiàn)在正在按照中藥、天然藥物注冊分類I進行研究開發(fā)，用于癡呆的防治。為了進行構(gòu)效關(guān)系的研究，我們一直在尋找有效的方法對該化合物進行結(jié)構(gòu)修飾。生物轉(zhuǎn)化（Biotransformation）是利用動、植物離體細胞或器官、微生物、或它們所產(chǎn)生的酶等對外源性化合物進行結(jié)構(gòu)修飾而獲得有價值產(chǎn)物的

2、生化反應。與有機合成方法相比，生物轉(zhuǎn)化具有工藝簡單、選擇性強、轉(zhuǎn)化率高、副產(chǎn)物少、條件溫和及環(huán)境友好等特點。目前為止，有關(guān)天然產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化研究較多，但對像知母皂苷BII這樣的甾體皂苷類化合物的生物轉(zhuǎn)化研究相對較少，特別是在其糖基化和C-3位糖鏈的選擇性水解方面。
　　 本論文以知母皂苷BII為底物，對本實驗室已保存的40多種酶及近百種微生物菌株進行活性篩選，發(fā)現(xiàn)一種酶（Toruzyme3.0L）和兩種微生物（黑曲霉Asperg

3、illus niger AS3.0739；熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens）能夠轉(zhuǎn)化知母皂苷BII生成其相應的衍生物。
　　 Toruzyme3.0L是一種商品化環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(cyclodextringlucanotransferase，CGTase)，發(fā)現(xiàn)其可以催化知母皂苷BII生成相對其極性增大的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。經(jīng)過知母皂苷BII制備級轉(zhuǎn)化，通過大孔吸附樹脂、薄層制備、開放C18柱層析及制備液相等

4、分離，共得到了9個轉(zhuǎn)化產(chǎn)物（產(chǎn)物1～9），并利用FAB-MS、HR-ESI-MS及NMR分析，鑒定其全部是知母皂苷BII的糖基化衍生物。并且該糖基化反應是利用非活化的糖源供體，可以在100℃下完成。
　　 黑曲霉Aspergillus niger AS3.0739是一種常見的產(chǎn)糖化酶菌株，發(fā)現(xiàn)其在全細胞培養(yǎng)時可以選擇性催化知母皂苷BII的C-22位羥基發(fā)生脫水反應，生成知母皂苷B（產(chǎn)物B1）。而從其發(fā)酵液中提取的全酶，在pH8.

5、0時，隨著轉(zhuǎn)化時間的延長，首先選擇性地依次水解知母皂苷BII的C-3位糖鏈的糖基，得到2個次生呋甾皂苷（產(chǎn)物H1、H2），又水解其C-26糖鏈，得到1個次生螺甾皂苷（知母皂苷AIII，產(chǎn)物H4）。產(chǎn)物H1的結(jié)構(gòu)為：(25S).26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-22-羥基-5β-呋甾皂苷-3β，26-二醇；產(chǎn)物H2的結(jié)構(gòu)為:(25S)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-22-羥基-5β-呋甾-3β，26-二醇-3-O—β-D-吡喃半乳糖苷。<

6、br>　　 本論文分離鑒定的一株菌-熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）可以催化知母皂苷BII生成大極性轉(zhuǎn)化產(chǎn)物（產(chǎn)物H3）。對該大極性轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進行制備分離，再通過波譜分析，尤其是二維核磁光譜(1H-1HCOSY,HSQC，HMBC)對產(chǎn)物H3的13C和1H進行全歸屬，確定產(chǎn)物H3的結(jié)構(gòu)是：(25S)-26-0-琥珀酸酯-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-22-羥基-5β-呋甾-3β，26-二醇-3-O-β-

7、D-毗喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷。實現(xiàn)了知母皂苷BII的琥珀酸酯化，該酯化反應的酯化位點是知母皂苷BIIC-26位糖鏈葡萄糖基的C-6’位羥基。
　　 鑒于Toruzyme3.0L對知母皂苷BII的糖基化反應可以利用非活化糖源供體，且在100℃下還可以完成的新顏性．我們進行了其中糖基化酶的分離純化，結(jié)構(gòu)分析及酶學特性的研究。以催化知母皂苷BII發(fā)生糖基化反應為酶活篩選指標，利用凝膠色譜、離子交換層析等方法，純化

8、得到了其中的目的酶蛋白；經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測為單一條帶；然后切割目的蛋白條帶，胰蛋白酶降解、MALDI-TOF/TOF和ESI-Q-TOF-MS測定，數(shù)據(jù)庫檢索，確定了該糖基化酶的結(jié)構(gòu)，與已報道的來源于Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（Cyclodextrin-glycosyltransferase，CGTase，EC2.4.1.19）同源，該酶分子量為78.4

9、kD，屬于GH13家族（α-淀粉酶家族）。以知母皂苷BII為底物，Toruzyme3.0L最佳反應pn值為8.0，在pH4～10范圍內(nèi)相對穩(wěn)定；最佳反應溫度為100℃，在100℃煮沸6h后仍然能保持60％以上的活性；在最佳反應溫度100℃時，反應速度很快，即使使用很少的酶液，也無法檢測出該酶的反應速度；在60℃下10min達到最大催化活性。
　　 另外，本論文還發(fā)現(xiàn)α-淀粉酶和CGTase這些GH13家族的酶均可以利用非活化糖源

10、供體催化知母皂苷BII發(fā)生糖基化反應，而其他種類的淀粉酶，如γ-淀粉酶卻沒有這樣的活性。初步探討，該酶催化發(fā)生糖基化反應的機理可能是：首先水解含有α-1，4葡萄糖苷鍵的糖源，釋放出被激活的葡萄糖基，然后這種葡萄糖基被隨機的加成到知母皂苷BII糖鏈的末端葡萄糖基上。同時還首次發(fā)現(xiàn)了黑曲霉Aspergillus nigerAS3.0739的胞外酶在pH8.0時可以選擇性水解知母皂苷BII的糖鏈；熒光假單胞菌Pseudomonas fluor