知母皂苷BII單克隆抗體的制備及其應(yīng)用的研究.pdf

1、現(xiàn)代藥理作用研究表明,中藥知母具有抗病原微生物、抗血小板聚集、降血糖、降血壓、抗炎、抗衰老、降低轉(zhuǎn)氨酶等多種活性,主要活性成分為知母皂苷(Timosaponin,TS)。其中知母皂苷BⅡ(Timosaponin BⅡ,TSBⅡ)是知母皂苷中含量最大且專屬性成分,2010年《藥典》把TSBⅡ的含量作為知母藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)之一。TSBⅡ可以顯著改善多種擬癡呆動(dòng)物模型的學(xué)習(xí)記憶功能,其作用機(jī)理為上調(diào)膽堿能N&M受體,改善腦缺血及缺血損傷。目

2、前TSBⅡ正在按照中藥、天然藥物注冊(cè)分類Ⅰ進(jìn)行研究開發(fā),對(duì)于早老性癡呆、血管性癡呆及腦卒中的預(yù)防和治療,具有較好的新藥開發(fā)前景。
　　 本研究的目的是通過制備TSBⅡ的單克隆抗體,建立測(cè)定TSBⅡ含量的ELISA方法,并利用該單克隆抗體探索分離純化TSBⅡ的親和層析技術(shù)。
　　 主要的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 (1)以高碘酸鈉法成功合成了免疫抗原,平均每個(gè)載體分子上連接9個(gè)TSBⅡ分子,可以免疫小鼠;3次加強(qiáng)免疫后選

3、擇效價(jià)為32000的小鼠作為免疫脾細(xì)胞的供體,使用PEG法促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與免疫細(xì)胞的融合,經(jīng)過克隆化和篩選,獲得了一株最佳的能穩(wěn)定分泌特異性抗體的細(xì)胞株EG9D2H5H6;經(jīng)接種小鼠、腹水誘導(dǎo)法產(chǎn)生大量抗體,用Protein G親和層析柱分離純化腹水,凍干后的單克隆抗體平均產(chǎn)量為7.44mg/ml,單抗的分子量約為150kD。
　　 (2)利用單抗建立測(cè)定TSBⅡ含量的ELISA方法,回歸方程為y=1.1192-0.2

4、222×ln(x),相關(guān)系數(shù)為R=0.9946,直線范圍為100 ng/ml-3.125ng/ml,靈敏度為27.03 ng/ml,4.34 ng/ml為其最低檢測(cè)限,與結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率很低,精密度、準(zhǔn)確度均較好。該方法與傳統(tǒng)的方HPLC-ELSD和HPLC質(zhì)譜聯(lián)方法相比,具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、前處理簡(jiǎn)單、易操作、反應(yīng)速度快、檢測(cè)費(fèi)用低、適于現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大批量樣本分析等優(yōu)點(diǎn),可以為中藥知母的質(zhì)量控制提供一種檢測(cè)技術(shù)。
　　

5、 (3)利用單抗制備了一個(gè)0.71ml的親和層析柱,以夾心ELISA檢測(cè)抗體偶聯(lián)率為97.41％,即每毫升膠偶聯(lián)11.64mg抗體;該柱絕對(duì)柱容量為86.498μg;選擇0.1 mol/L Tris-HCL0.5 mol/LNaCL(PH9.7)+40％甲醇(v/v)作為洗脫液,流速為0.5ml/min,實(shí)驗(yàn)5次的平均回收率為99.01％,至少能在30天之內(nèi)使用十次以上。該法操作簡(jiǎn)單,且能很好的分離純化TSBⅡ,這對(duì)于研究TSBⅡ的藥用