基于磁性納米粒子PCR的高通量單核苷酸多態(tài)性分型方法.pdf

1、單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs)是人類基因序列中最常見的變異，對其研究有助于解釋個體的表型差異、不同群體和個體對復(fù)雜疾病的易感性、以及對各種藥物的耐受性和對環(huán)境因子的反應(yīng)。因此，建立一種快速、準(zhǔn)確、高通量且適用于臨床的SNP分型方法非常重要。目前已報道的眾多SNP分型方法中，絕大多數(shù)需要對包含有SNP位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化、濃縮，這是一個即費(fèi)時又費(fèi)力的工作，而且很難滿足未來對分

2、型自動化的要求。
　　隨著納米技術(shù)的迅速發(fā)展，納米材料逐漸被應(yīng)用到生命科學(xué)領(lǐng)域，為其研究和發(fā)展提供了新的技術(shù)和手段。磁性納米粒子(Magnetic Nanoparticles，MNPs)作為納米材料的一個重要組成部分，由于其特殊的物理化學(xué)性質(zhì)和生物相容性，目前已被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞的分離、免疫測定、蛋白質(zhì)和酶的固定以及DNA的檢測等。
　　本文將磁性納米粒子的富集功能和生物芯片“并行”讀出的高通量特性結(jié)合起來，首先發(fā)展了一種基于

3、磁性納米粒子PCR擴(kuò)增和等位基因特異性雙色熒光雜交的分型方法，用以檢測亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因的677位點(diǎn)(C→T)的單核苷酸多態(tài)性，應(yīng)用該方法對126個樣本MTHFR基因的C677T多態(tài)進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)下游引物連接在磁性納米粒子表面時，能與反應(yīng)體系中的模板DNA以及上游引物通過PCR擴(kuò)增出所需的目的片段。當(dāng)雜交溫度在38℃時，所使用的熒光探針能夠精確的區(qū)分樣品的SNP基因型，分型結(jié)果經(jīng)測序得到驗(yàn)證。
　　為了

4、進(jìn)一步降低分型成本，在基于本文提出的MNPs-PCR分型方法的基礎(chǔ)上，通過使用兩條帶有野生、突變通用標(biāo)簽(tag)的探針和雙色熒光(Cy3、Cy5)標(biāo)記的通用檢測子，進(jìn)一步降低了樣本的分型成本。本文中對96個樣本的MTHFR基因C677T位點(diǎn)以及AGT基因的M235T位點(diǎn)用這種新型方法進(jìn)行了高通量分型檢測。上述基于磁性納米粒子PCR的兩種SNP分型方法不僅省略了傳統(tǒng)方法中純化、濃縮PCR產(chǎn)物的繁瑣步驟，而且獲得了很好的分型結(jié)果。接著驗(yàn)證