結(jié)合聚合連接反應(yīng)和磁性分離系統(tǒng)的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方法的建立.pdf

1、隨著大量與人類疾病和藥物治療相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(Single-NucleotidePolymorphism，SNP)的發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)了多種對(duì)SNP進(jìn)行檢測(cè)的方法和技術(shù)。然而，大多數(shù)方法由于受到檢測(cè)靈敏度低，需要昂貴的實(shí)驗(yàn)設(shè)備及試劑，或需要專業(yè)操作人員等方面的限制，無法在常規(guī)的臨床檢驗(yàn)中推廣使用。
　　 設(shè)計(jì)特定組成和功能的檢測(cè)探針，建立了一種對(duì)SNP位點(diǎn)、短片段插入或缺失位點(diǎn)進(jìn)行分型檢測(cè)的新方法。該法主要包括以下幾個(gè)步驟：(1)對(duì)

2、SNP位點(diǎn)所在片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(2)在DNA聚合酶的延伸作用(Fill-in)和DNA連接酶的連接作用(Ligation)雙重特異性保證的基礎(chǔ)上，對(duì)等位基因的檢測(cè)位點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別；(3)基于磁分離技術(shù)的原理，使用鏈親和素磁性微粒對(duì)含有檢測(cè)位點(diǎn)等位基因特異性片段進(jìn)行純化，減少反應(yīng)體系中其它成分對(duì)后續(xù)分型檢測(cè)的影響，進(jìn)一步增強(qiáng)檢測(cè)體系的特異性。(4)對(duì)純化后的等位基因特異性片段進(jìn)行擴(kuò)增以增加檢測(cè)靈敏度；(5)通過瓊脂糖凝膠電泳、ELISA檢

3、測(cè)或通用寡核苷酸芯片技術(shù)三種不同方式實(shí)現(xiàn)分型檢測(cè)。
　　 瓊脂糖凝膠電泳和ELISA檢測(cè)實(shí)現(xiàn)的分型，不需依靠昂貴的檢測(cè)儀器及試劑，即可達(dá)到快速、特異性好和靈敏度高等特點(diǎn)，該法能夠在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤組織等不均一樣本進(jìn)行低拷貝等位基因的檢測(cè)。如果利用通用寡核苷酸芯片技術(shù)實(shí)現(xiàn)基因分型，可以使用單色熒光標(biāo)記系統(tǒng)，以簡單的熒光掃描設(shè)備和簡便的結(jié)果分析方法實(shí)現(xiàn)中、高通量的SNP分型檢測(cè)。
　　 以苯二異硫氰酸酯(p-phenyl

4、ene diisothiocyanate/1,4-phenylene diisothiocyanate，PDC)作為雙功能交聯(lián)劑，對(duì)氨基末端磁性微粒的表面進(jìn)行修飾而制備活化磁性微粒。通過將鏈親和素共價(jià)偶聯(lián)于活化磁性微粒表面而制備鏈親和素磁性微粒用于SNP分型檢測(cè)研究。
　　 用聚合連接反應(yīng)-瓊脂糖凝膠電泳方法對(duì)藥物代謝酶基因CYP3A4、CYP2B6和藥物靶點(diǎn)基因EGFR(Epidermal growth factor rece

5、ptor)的8個(gè)SNP位點(diǎn)和一個(gè)短片段插入/缺失位點(diǎn)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，此方法具有很好的特異性和靈敏度，能夠?qū)H占0.5％比例的突變型等位基因從混合樣本中檢測(cè)出來。對(duì)35例非小細(xì)胞肺癌組織樣本EGFR，c.2573T＞G(L858R)位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果顯示，用聚合連接反應(yīng)-瓊脂糖凝膠電泳方法能夠檢測(cè)出8例雜合子樣本，而用常規(guī)的直接測(cè)序方法僅能夠檢測(cè)出2例雜合子樣本。表明此方法具有較高的靈敏度，適合于對(duì)腫瘤等不均一組織樣本的SNP檢測(cè)研究。

6、和瓊脂糖凝膠檢測(cè)方法相比，8例雜合子樣本的酶聯(lián)免疫檢測(cè)結(jié)果，其陽性和陰性信號(hào)的對(duì)比結(jié)果更為明顯，表明ELISA顯色具有更高的靈敏度，同時(shí)可實(shí)現(xiàn)更大的通量。
　　 以聚合連接反應(yīng)-通用寡核苷酸檢測(cè)芯片對(duì)藥物代謝酶相關(guān)SNP檢測(cè)的技術(shù)進(jìn)行了初步研究，藥物代謝酶CYP2D6基因上的7個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行芯片檢測(cè)，各個(gè)位點(diǎn)的陽性雜交區(qū)域均具有明顯的熒光信號(hào)值，并且具有明顯的陽性和陰性信號(hào)對(duì)比，顯示了建立的聚合連接反應(yīng)-通用寡核苷酸芯片檢測(cè)方