腫瘤易感性相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性驗證及其基于納米材料的新型檢測方法研究.pdf

1、單核苷酸多態(tài)（single nucleotide polymorphism，SNP）是指在基因組的水平上由于單個核苷酸發(fā)生變異，并由此導(dǎo)致的DNA序列的多態(tài)性。SNP被認為是決定人類疾病易感性與藥物反應(yīng)差異的一個確定因素，可導(dǎo)致不同個體之間對惡性腫瘤等復(fù)雜疾病的易感性差異，因此對其檢測具有重要的生物醫(yī)學(xué)價值。
　　兩對引物-聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction with confronting two-

2、pair primer，PCR-CTPP）技術(shù)作為一種SNPs檢測的新技術(shù)，是在序列特異性聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（polymerase chain reaction with sequence specific primer，PCR-SSP）和多重PCR技術(shù)基礎(chǔ)上建立的。PCR-CTPP技術(shù)的使用有助于臨床和流行病學(xué)大樣本腫瘤易感基因的篩選，同時對腫瘤發(fā)病機制的研究、致癌物暴露所引發(fā)腫瘤風險的評估有極大的幫助。
　　毛細管電泳（Capi

3、llary Electrophoresis，CE）是繼高效液相色譜技術(shù)（high performance liquid chromatography，HPLC）之后在傳統(tǒng)的平板凝膠電泳基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型液相分離技術(shù)。CE以高強度直流電場為驅(qū)動力，DNA片段因離子表面積和分子外形的差異導(dǎo)致遷移率時間的不同，從而能夠檢測SNP。利用CE技術(shù)，可以直接檢測SNP突變類型及其位置。其中，激光誘導(dǎo)熒光（laser induced fluor

4、escence，LIF）方法是目前靈敏度最高、應(yīng)用最廣的一種CE檢測方式。
　　氧化石墨烯（Graphene oxide,GO）作為石墨烯的衍生物，易溶于水，具有較好的生物相容性。氧化石墨烯具有熒光猝滅效應(yīng)，基于共振能量轉(zhuǎn)移的原理，通過檢測“Fluorescence Off-Fluorescence On”過程，可以實現(xiàn)對生物大分子、無機小分子的檢測。
　　基于此，通過與我校同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院密切合作，我們采用不同的方法

5、驗證基因多態(tài)性與相關(guān)腫瘤易感性之間的關(guān)聯(lián)性，在此基礎(chǔ)上嘗試建立了一種基于氧化石墨烯和FITC標記的DNA探針（FITC-DNA）通過CE-LIF對特定寡核苷酸序列進行分離檢測的方法，論文的完成工作如下：
　?。?）我們基于PCR-CTPP技術(shù)檢測了DNA修復(fù)基因XRCC1基因SNP多態(tài)性，探討了其與神經(jīng)膠質(zhì)瘤遺傳易感性的關(guān)聯(lián)性。其基本策略是依據(jù)XRCC1基因三個不同的SNP位點Arg194Trp（rs1799782）、Arg280

6、His（rs25489）和Arg399Gln（rs25487）來設(shè)計兩對不同的引物，經(jīng)過一次PCR擴增反應(yīng)之后進行常規(guī)凝膠電泳，之后分析其SNP等位基因。由于引物3‘端堿基為引發(fā)延伸的起點，具有較高的穩(wěn)定性，如果有堿基錯配發(fā)生，在合適的PCR條件下，擴增效率將會十分低下，而正確的配對則能夠使PCR擴增順利進行。通過病例—對照研究發(fā)現(xiàn)：XRCC1密碼子194Trp等位基因為中國人群神經(jīng)膠質(zhì)瘤高危致病基因，399位Gln等位基因同樣存在著致

7、神經(jīng)膠質(zhì)瘤的風險。實驗證實，這一方法可以用于基因多態(tài)性與腫瘤遺傳易感性的研究，這一工作為研究XRCC1多態(tài)性在中國人群發(fā)生神經(jīng)膠質(zhì)瘤的潛在作用提供了證據(jù)，同時這種DNA修復(fù)基因與神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)性的分析為深入探討腫瘤致病的遺傳與環(huán)境因素提供了重要的參考。
　?。?）利用Meta薈萃分析方法，探討了在葉酸代謝途徑中基因多態(tài)性研究最多的MTHFR C677T基因與食管癌發(fā)病之間的關(guān)系。雖然此前已有多項實驗進行展開，而且研究結(jié)果也表明：M

8、THFR C677T基因與食管癌的發(fā)病風險之間存在一定的關(guān)聯(lián)性，但是到目前為止，其結(jié)論并不完全一致。本課題利用Meta分析方法，通過定量合成原始的研究數(shù)據(jù)，其目的是將樣本量加以擴大，并在此基礎(chǔ)上進行薈萃分析，從而能夠得出更為客觀和更加可信的結(jié)論。通過分析比較MTHFR C677T雜合基因型（CT）、突變純合基因型（TT）和野生純合型（CC）在病例組及對照組的分布發(fā)現(xiàn)：攜帶CT基因型的個體（OR=1.37，95％CI=0.79-1.84）

9、及TT基因型的個體（OR=1.72，95%CI=1.12-2.43）患食管癌的發(fā)病風險顯著增加（P<0.05），這一結(jié)論也支持了MTHFR C677T基因在食管癌發(fā)病過程中起到了較為重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)攜帶MTHFR C677T CT基因型與TT基因型的漢族人群較其他種族人群有著相對更高的患病風險；同時也驗證了MTHFR C677T TT基因型較CC基因型患病風險更高。
　?。?）以上述驗證的中國人群神經(jīng)膠質(zhì)瘤高危致病基因XRCC

10、1 Arg194Trp的引物序列作為靶標序列，嘗試建立了一種基于氧化石墨烯（GO）的毛細管電泳（CE）-激光誘導(dǎo)熒光LIF檢測手段，利用FITC-DNA探針對該特定寡核苷酸序列進行分離檢測的方法。其具體策略為利用GO吸附FITC標記的互補DNA探針后淬滅FITC的熒光，再利用FITC-DNA/GO復(fù)合物對溶液中的該特定寡核苷酸序列T1進行識別，當存在靶標序列時，其通過DNA間的堿基互補配對將FITC-DNA從氧化石墨烯上解離下來，形成F