微生物生態(tài)學研究中通用引物的覆蓋率評估以及高通量測序結果的自動化處理.pdf

1、微生物群落結構是微生物生態(tài)學研究的重要內容，分子生物學方法的應用使得對環(huán)境中未培養(yǎng)微生物的研究成為了可能，促使微生物生態(tài)學研究從基于培養(yǎng)的時代進入了分子生物學的時代。在分子生物學時代，我們面臨的問題主要有兩個，一個是如何無偏差的從環(huán)境樣品中獲得序列數(shù)據(jù)，另一個是如何快速、有效地從序列數(shù)據(jù)中提取有價值的信息。
　　序列數(shù)據(jù)的獲得主要通過聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，簡稱PCR)進行，通過PCR技

2、術可以直接從總的環(huán)境樣品中選擇性擴增特定的基因片段，從而對微生物群落結構進行分析。但是PCR過程中的很多因素都會導致有偏向性的PCR擴增，其中引物的偏向性會引起部分微生物類型的選擇性擴增，導致該方法得到的微生物群落結構和真實情況出現(xiàn)偏差。全面理解各種通用引物的覆蓋率對于正確闡釋PCR結果具有重要作用。之前關于引物覆蓋率的研究基本上都是定性或半定量的，所用數(shù)據(jù)多來自RDP等公共數(shù)據(jù)庫，這些數(shù)據(jù)庫中的序列很多是通過PCR方法得到的，數(shù)據(jù)結構

3、已經受到PCR引物的影響。而且之前的研究也沒有考慮引物和模板之間不同位置的錯配對覆蓋率的影響，尤其是引物3'端的4位堿基所發(fā)生的錯配。
　　本研究對目前微生物生態(tài)學研究中面臨的兩個問題都進行了初步的研究。首先在RDP數(shù)據(jù)集和7個元基因組數(shù)據(jù)集的基礎上對8個常用的細菌16S rRNA基因通用引物進行了非覆蓋率的評估。在域的水平，每個引物在8個元基因組數(shù)據(jù)中的非覆蓋率平均值都比相應引物在RDP數(shù)據(jù)中的非覆蓋率值要高，除27F外，其它引

4、物的該比值都在4以上，對于519R來說這個比值高達11.5。在門的水平，引物末4位堿基的單錯配(single mismatch)對非覆蓋率顯示出重要影響，尤其是對338F和519F這兩個引物，它們使338F在5個門以及519F在10個門中的非覆蓋率提高了至少20％。對于每個引物，我們分析了引起其高非覆蓋率的主要錯配類型，以及這些錯配類型在各個門中的分布，然后在這些錯配類型的基礎上通過引入簡并堿基或門特異性的引物序列，對6個引物進行了改進

5、，改進后的引物可以覆蓋更廣的細菌譜。
　　在序列數(shù)據(jù)的處理過程中，主要問題是缺少能夠全面滿足微生物生態(tài)學研究的系統(tǒng)化、自動化的軟件。目前基于序列的微生物生態(tài)學研究主要分為兩個階段，一個是可操作分類單元(Operational Taxonomic Unit，簡稱OTU)的定義，可以大致提供樣品的微生物多樣性信息;另一個是序列的生物學分類，可以提供樣品的微生物種類信息。一般的研究都包括這兩個過程，但是現(xiàn)有的軟件基本上都只能完成其中一個

6、過程，滿足我們的部分需求，而且大都限于16S rRNA基因序列的處理。隨著高通量測序技術的發(fā)展以及測序費用的下降，單次研究所要處理的數(shù)據(jù)從幾百條上升到了幾萬甚至幾十萬條，通過軟件自動化的處理這些數(shù)據(jù)是廣大微生物生態(tài)學家的共同需求。
　　為了解決數(shù)據(jù)處理過程中的難題，我們開發(fā)了軟件OTU_Misess。OTU_ Misess是一個整合了序列的OTU定義和生物學分類的自動分析軟件，除了分析細菌和古生菌的序列(16S rRNA)，還能分

7、析真核生物(18S/ITS)和功能基因的序列，分析過程主要分為兩個階段:第一階段是從峰圖文件中讀取堿基，經過序列質量和長度篩選之后去除載體和引物來源的序列片段，生成有效序列文件;第二階段是對有效序列進行分析，包括OTU定義、微生物分類和末端限制性片段長度分析(Terminal Restriction Fragment，簡稱T-RF)。這兩個過程可以一起進行，也可以分開進行。一次運行可以同時分析不同樣品來源的數(shù)據(jù)，并且根據(jù)來源列出不同樣品

8、的群落組成。通過對已發(fā)表文章中的834條16S rRNA基因序列、181條18S rRNA基因序列以及975條ITS基因序列進行OTU_Misess分析，并和Greengenes以及RDP的分類結果進行比較，我們證明了OTU_Misess在16S rRNA、18S rRNA以及ITS基因序列分類功能上的可信度。
　　我們的工作對分子生物學方法在微生物生態(tài)學研究中的應用所面臨的兩個階段的問題進行了初步研究，為了更深入的解決這些問題，