根尖周感染的根管微生物生態(tài)學研究.pdf

1、第一章根尖周感染的根管內細菌多樣性及系統(tǒng)發(fā)育分析
　　 研究目的：
　　 通過16S rRNA基因克隆文庫技術和限制性內切酶PCR-RFLP指紋圖譜分析慢性根尖周炎初次感染和根管治療后持續(xù)感染根管內細菌群落的組成情況，了解根管內細菌群落構成的多樣性特征。
　　 材料方法：
　　 收集慢性根尖周炎初次感染和根管治療后持續(xù)感染病例，提取細菌總DNA，采用通用引物PCR擴增細菌的16S rRNA基因，構建克隆文

2、庫，通過HaeⅢ限制性內切酶對細菌16S rRNA基因文庫中的克隆進行PCR-RFLP限制性酶切片段長度多樣性分析，將所有陽性克隆分為若干個可操作分類單元(OTU)，選取代表克隆測序并構建系統(tǒng)發(fā)育樹。
　　 結果：
　　 構建了三個慢性根尖周炎初次感染和兩個根管治療后持續(xù)感染的16S rRNA基因克隆文庫。
　　 對于根管初次感染的16S rRNA基因克隆文庫，經(jīng)PCR-RFLP圖譜分析后代表測序的251個克隆中

3、，共獲得50類細菌，歸屬于5個細菌類群的24個細菌屬別，其中26類(52％)為未獲培養(yǎng)的細菌類別，有2類細菌為以前研究中未報道過的新類別。厚壁菌門(42％)和擬桿菌門(34％)的細菌種類最多。細菌分布具有個體差異性，主要優(yōu)勢菌包括普氏菌、牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌、Solobacterium moorei、月形單胞菌、小桿菌、彎曲桿菌和消化鏈球菌。
　　 對于根管持續(xù)感染的16S rRNA基因克隆文庫，經(jīng)PCR-RFLP圖譜分析

4、后代表測序的179個克隆中，共獲得30類細菌，細菌種類和數(shù)量較初次感染減少，菌群構成也與初次感染不同，歸屬于5個細菌類群的11個細菌屬別，其中14類(46.7％)為未獲培養(yǎng)的細菌類別，有1類細菌為以前研究中未報道過的新類別。螺旋體門(33.3％)和擬桿菌門(26.7％)的細菌種類最多。細菌分布具有個體差異性，主要優(yōu)勢菌包括密螺旋體、牙齦卟啉單胞菌、普氏菌、大腸桿菌和韋榮球菌，其他檢出的細菌還包括產(chǎn)線菌，具核梭桿菌，牙齦二氧化碳嗜纖維菌，

5、纖毛菌和奈瑟氏菌。
　　 結論：
　　 慢性根尖周炎初次感染和根管治療后持續(xù)感染是由多種厭氧菌組成的混合感染，具有豐富的菌群多樣性特征。未獲培養(yǎng)類別的細菌組成了根尖周初次感染和持續(xù)感染的主要微生物群落。根管初次感染與持續(xù)感染的菌群構成和數(shù)量均有所區(qū)別。
　　 第二章根管治療后持續(xù)感染的微生物定植模式分析
　　 研究目的：
　　 采用組織形態(tài)學和電鏡觀察的方法了解根管治療失敗后持續(xù)感染根管微生物的組

6、織結構和定植模式，為制定根尖周持續(xù)感染的有效治療策略提供實驗依據(jù)。
　　 材料方法：
　　 收集16例根管治療失敗后的難治性根尖周炎病例，采用顯微根尖手術切除根尖標本。6例根尖標本通過組織學染色觀察根尖周組織的組織學狀態(tài)和微生物的形態(tài)及其在根尖的定植情況。5例根尖標本縱向劈開后在掃描電鏡下分別觀察牙本質面和牙根表面的細菌生物膜形態(tài)和分布。5例根尖標本在透射電鏡下觀察根管生物膜的形態(tài)和分布。
　　 結果：
　

7、　 (1)6例進行組織學染色的根尖標本中，有5例可觀察到菌斑附著于根管壁表面，并沿牙本質小管侵入到牙本質深層，浸入深度由100μm至500μm不等。6例標本的根尖周組織均形成了根尖囊腫，有1例標本根尖囊腫的囊腔內有異物顆粒形成的結晶體，另有1例標本在根尖囊壁中出現(xiàn)膽固醇晶體沉積，表現(xiàn)為狹長的針形裂隙。
　　 (2)根管內壁牙本質面和根尖牙骨質面在掃描電鏡下均可觀察到菌斑生物膜結構，膠原纖維網(wǎng)形成支架結構，密集的細菌群落鑲嵌于膠

8、原纖維網(wǎng)支架之中，被結構致密的胞外多糖基質覆蓋包裹，構成生物膜。細菌組成以球菌和桿菌為主。
　　 (3)根尖標本橫斷面切片在透射電鏡下可觀察到根管充填物與根管壁之間形成的不規(guī)則間隙區(qū)內有大量球菌包繞呈團塊狀，部分細菌分解崩裂導致胞壁不完整。
　　 結論：
　　 微生物在根管治療后持續(xù)感染的根管內牙本質面和牙根外牙骨質面以菌斑生物膜的方式定植，并可侵入牙本質小管達500μm，是造成根管治療失敗的重要原因。膽固醇晶體

9、和根管內異物是導致根管治療失敗的非微生物因素。
　　 第三章光活化消毒控制根尖周感染根管內細菌的實時定量檢測
　　 研究目的：
　　 采用real-time PCR的定量方法評價光活化消毒技術處理初次感染和再次感染根管內菌斑生物膜的抗菌作用，為進一步提高根管治療成功率提供新的根管消毒方法。
　　 材料方法：
　　 收集15例慢性根尖周炎初次感染和8例根管治療后持續(xù)感染病例，去除壞死牙髓組織或根管充

10、填物后，分別進行根管治療前、根管機械化學預備后以及光活化消毒處理后根管內樣本的采集，提取細菌總DNA，采用real-time PCR定量檢測根管內細菌的總量，比較各組之間細菌總量的差別。
　　 結果：
　　 治療前初次感染的根管內細菌總數(shù)較持續(xù)感染的根管內細菌總數(shù)多(P=0.001)。對于初次感染病例，根管內細菌總數(shù)治療前為2.40×106，經(jīng)根管機械化學預備后降至1.78×104(降低99.26％)，光活化消毒后降至7

11、.41×103(降低99.69％)。對于持續(xù)感染病例，根管內細菌總數(shù)治療前為2.95×105，經(jīng)根管機械化學預備后降至5.13×103(降低98.26％)，光活化消毒后降至1.66×103(降低99.44％)。經(jīng)雙因素方差分析比較，根管機械化學預備和光活化消毒后，細菌總量較治療前均有明顯減少(P=0.000)，光活化消毒可進一步減少根管機械化學預備后根管內的細菌總量，二者聯(lián)合應用的滅菌效果優(yōu)于單純使用根管機械化學預備(P=0.048)。