金黃色葡萄球菌中clpP、clpX及SarZ重要致病性基因功能的研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌是重要的人類致病菌，酪蛋白裂解酶P(clpP)、酪蛋白裂解酶X(clpX)及葡萄球菌附屬調(diào)節(jié)子Z(SarZ)是金黃色葡萄球菌中調(diào)節(jié)毒力因子的重要蛋白，clpP蛋白和clpX蛋白屬于CLp蛋白水解酶，在生物體蛋白質(zhì)代謝過程的調(diào)節(jié)和清除不可逆損傷蛋白的過程中發(fā)揮重要作用。SarZ蛋白屬于SarA家族蛋白，是一個(gè)二聚體的DNA結(jié)合蛋白，它能和特異DNA區(qū)域結(jié)合來調(diào)控hla（溶血素基因）和附屬基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)(是S.aureus中最早

2、發(fā)現(xiàn)的毒力因子調(diào)控因子之一，agr)。MgrA和SarZ蛋白是同系物都屬于SarA家族蛋白，研究發(fā)現(xiàn)MgrAC12、SarA和SarZC13等蛋白分子半胱氨酸是關(guān)鍵的酶活中心，通過半胱氨酸的磷酸化修飾引起了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中氫鍵網(wǎng)絡(luò)的變化而導(dǎo)致構(gòu)象的變化，調(diào)節(jié)金黃色葡萄球菌毒力因子的產(chǎn)生以及細(xì)菌對(duì)萬古霉素的抗性，主要研究結(jié)果分為兩部分:
　　 1.clpP蛋白水解酶底物研究.利用同源重組原理在newman基因組中成功敲除clpP基因。

3、
　　clpP敲除突變體與野生型相比致病性明顯下降。通過pyj335∷clpP質(zhì)粒構(gòu)建，進(jìn)行基因功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，恢復(fù)到了野生型。尿素酶瓊脂板結(jié)果顯示，尿素酶活性明顯比野生型增加.通過觀察2％牛奶板，發(fā)現(xiàn)胞外蛋白酶活性也增加了。利用紅霉素(erm)抗性標(biāo)記基因，在newman菌株中進(jìn)行clpX敲除突變菌株的篩選。利用細(xì)菌雙雜交試劑盒，探究clpP和clpX蛋白在細(xì)菌體內(nèi)的相互作用。
　　 2.SarZ蛋白C13的半胱氨酸磷酸

4、化修飾與DNA結(jié)合特性及毒力研究.
　　 研究表明在SarZ蛋白的C-、N-末端及螺旋轉(zhuǎn)角螺旋(winged helix-turn-helixmotif(wHTH)）區(qū)域氨基酸進(jìn)行一系列的點(diǎn)突變可以改變蛋白與DNA的結(jié)合能力。
　　 通過電泳遷移率試驗(yàn)(EMSA)，發(fā)現(xiàn)SarZ(C13E)突變以后能夠減弱蛋白和DNA的結(jié)合能力，而SarZ(C13S)提高了與DNA的結(jié)合能力。
　　 牛奶板結(jié)果也顯示法對(duì)SarZ1

5、3C進(jìn)行點(diǎn)突變以后能改變蛋白的折疊方式，造成蛋白特性與功能的改變。
　　 SarZ蛋白中存在的半胱氨酸(cys)磷酸化修飾在金黃色葡萄球菌中是一種新的氧化還原蛋白的翻譯后修飾方式。
　　 通過對(duì)SarZ蛋白的研究，類推到SarA家族蛋白—MgrA(最近發(fā)現(xiàn)的金黃色葡萄球菌自溶和毒力調(diào)控因子)，MgrAC12E進(jìn)行點(diǎn)突變，研究蛋白結(jié)構(gòu)改變對(duì)其功能的影響。ClpP和ClpX蛋白在金黃色葡萄球菌的生理和毒力方面具有重要作用，但