二型真菌形態(tài)轉(zhuǎn)換相關(guān)非編碼RNA表達(dá)譜的研究.pdf

1、非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)是一類在生物體中廣泛存在的且不編碼蛋白質(zhì)的功能性RNA分子，直接在RNA水平發(fā)揮作用，影響生物體的生命活動。動植物ncRNAs的研究已有大量的文獻(xiàn)報(bào)道，而真菌ncRNAs的研究報(bào)道則相對較少。白色念珠菌（Candida albicans，C.albicans）作為一種主要的人體侵染性致病真菌，在免疫功能低下的個(gè)體中極易引起各種感染和病癥。響應(yīng)周圍環(huán)境的變化而改變自身的生長形態(tài)，實(shí)現(xiàn)

2、酵母形態(tài)、假菌絲形態(tài)及菌絲形態(tài)之間的可逆轉(zhuǎn)換是C albicans的顯著特性之一，對于C.albicans的致病性也至關(guān)重要。本課題以酵母型和菌絲型C.albicans菌株為研究對象，分別構(gòu)建其小非編碼RNA(small non-coding RNA，sncRNA)轉(zhuǎn)錄組深度測序文庫，采用Hiseq2000測序系統(tǒng)進(jìn)行測序。通過生物信息學(xué)技術(shù)和方法，本文對其sncRNA表達(dá)譜進(jìn)行了比較分析，并探討了其分子生物學(xué)特性?，F(xiàn)將研究結(jié)果小結(jié)如下

3、:
　　 1、利用含10％血清的1640液體培養(yǎng)基在37℃下分別誘導(dǎo)C.albicans野生型SC5314菌株及非致病型2.538菌株菌絲的發(fā)生。在經(jīng)過對培養(yǎng)時(shí)間、細(xì)胞狀態(tài)及細(xì)胞密度等因素的反復(fù)試驗(yàn)并調(diào)整后，最終將兩種不同菌株的酵母型細(xì)胞均誘導(dǎo)成為了具有典型真菌絲形態(tài)特征的C.albicans菌絲型細(xì)胞，構(gòu)建了穩(wěn)定誘導(dǎo)二型真菌C.albicans菌絲發(fā)生的方法體系。結(jié)果顯示:菌濃度保證在105數(shù)量級的單細(xì)胞狀態(tài)C.albican

4、s細(xì)胞培養(yǎng)3h后能形成大量具有經(jīng)典菌絲形態(tài)的菌絲型細(xì)胞。
　　 2、基于傳統(tǒng)熱酸性酚提取真菌總RNA的方法，在酚與菌體細(xì)胞混合時(shí)加入適量無RNA酶瓷珠一同混勻，再水浴高速振蕩，以增強(qiáng)破壁效果，使RNA從細(xì)胞中迅速釋放。瓊脂糖凝膠電泳和Agilent2100的檢測結(jié)果表明:在4個(gè)樣品（即SC5314菌株及2.538菌株的酵母型與菌絲型細(xì)胞樣品各一個(gè)）中加入了無RNA酶瓷珠一同振蕩提取獲得的總RNA在數(shù)量和質(zhì)量上都得到了保證。

5、>　　 3、采用割膠回收的方法分別從四個(gè)總RNA樣品中分離18-40 nt的小RNA分子用于小RNA文庫構(gòu)建并測序。測序數(shù)據(jù)的分析結(jié)果顯示:實(shí)際有效的小RNA分子長度區(qū)間為14-44 nt，不僅包括了18-40 nt的小RNA分子，小于18 nt或大于40 nt的小RNA分子也在其中，說明割膠回收法具有高效分離小RNA分子的優(yōu)點(diǎn)。
　　 4、本課題采用HiseqTM2000測序系統(tǒng)對四個(gè)小RNA文庫進(jìn)行測序。在去除了四個(gè)小RN

6、A原始測序數(shù)據(jù)中無效的或低質(zhì)量的reads及接頭等后，每個(gè)樣品中均獲得了約99％的高質(zhì)量clean reads。4個(gè)樣品總計(jì)達(dá)128636135條小RNA高質(zhì)量clean reads。
　　 5、以SC5314 Assembly21基因組為參考，利用Bowtie0.12.7在允許2個(gè)錯配的條件下將小RNA高質(zhì)量clean reads映射到參考基因組上。結(jié)果顯示:4個(gè)樣本平均約74.8％的高質(zhì)量clean reads映射到rDNA

7、位點(diǎn)上。映射到tDNA的位點(diǎn)上的高質(zhì)量clean reads在4個(gè)樣品中分別約為4.5％，8.9％，5.5％和33.0％。其余映射到基因組上的高質(zhì)量clean reads則主要分布于已知編碼基因（ORF）與已知的ncRNAs類群（如反轉(zhuǎn)座子）上。最終只有不到6％的高質(zhì)量clean reads無法映射到參考基因組上。
　　 6、所有映射于基因組上的高質(zhì)量clean reads的長度與種類分布特征分析結(jié)果顯示:這些小ncRNAs主要

8、富集于19-34 nt的長度范圍內(nèi)，其中以22 nt小ncRNAs的豐度最高。另外，在26-34nt的長度范圍內(nèi)，兩個(gè)菌絲型細(xì)胞樣中的小ncRNAs豐度均比相應(yīng)的酵母型細(xì)胞樣中的要高些，提示分布于這一長度區(qū)間的某些小ncRNAs可能與C.albicans的形態(tài)轉(zhuǎn)換有關(guān)。
　　 7、利用生物信息學(xué)方法對映射于已知ncRNAs類群上的小ncRNAs的分析結(jié)果顯示，4個(gè)樣品中均以來源于反轉(zhuǎn)座子的ncRNAs占絕大多數(shù)。此外，對4個(gè)樣品

9、中這些反轉(zhuǎn)座子上的ncRNAs的特征分析結(jié)果表明:5'末端為A或U的22 nt小ncRNAs在這類小ncRNAs中最為豐富。這一結(jié)果與SC5314菌株中已報(bào)道過的小ncRNAs的特征是一致的，說明了本課題測序數(shù)據(jù)是可靠的。
　　 8、對4個(gè)樣中rRNA和tRNA來源的小ncRNAs的分布特征分析結(jié)果顯示:這兩類小ncRNAs均主要集中分布于19-36 nt長度區(qū)間，其中源于rRNA的小ncRNAs在23 nt位置出現(xiàn)最高峰;而源

10、于tRNA的小ncRNAs則在34 nt位置具有最高峰值。
　　 9、運(yùn)用microRNA預(yù)測軟件miRDeep2在嚴(yán)格的默認(rèn)參數(shù)設(shè)置下預(yù)測C.albicans中可能的microRNA候選物。在SC5314酵母型細(xì)胞中預(yù)測到2個(gè)microRNA候選物;在SC5314菌絲型細(xì)胞中預(yù)測到1個(gè)microRNA候選物;在2.538酵母型細(xì)胞中預(yù)測到8個(gè)microRNA候選物;在2.538菌絲型細(xì)胞中預(yù)測到6個(gè)microRNA候選物。并且