Th9-IL-9在實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程中的作用及意義.pdf

1、背景：動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心腦血管疾病和外周血管性疾病的主要病理學(xué)基礎(chǔ)，在西方發(fā)達(dá)國家是重要致死因素，近年來隨著生活水平的提高，也逐漸成為我國中老年人群的主要死亡原因之一。目前 AS的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，大量臨床和基礎(chǔ)研究表明，AS是一種慢性炎癥性疾病，包括CD4+T淋巴細(xì)胞在內(nèi)的多種免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子參與其中。Th9細(xì)胞是一種新發(fā)現(xiàn)的 CD4+T淋巴細(xì)胞亞群，初始CD4+T細(xì)胞受到抗原刺激后在轉(zhuǎn)化生

2、長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）和白細(xì)胞介素-4（interleukin-4，IL-4）的作用下可分化為 Th9細(xì)胞并分泌大量的 IL-9，其產(chǎn)生和功能受轉(zhuǎn)錄因子 PU.1調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)Th9細(xì)胞參與調(diào)節(jié)哮喘和炎癥性腸病等多種炎癥性疾病的發(fā)生，但當(dāng)前Th9細(xì)胞在AS進(jìn)程中作用研究甚少。Thl7細(xì)胞也是近年來發(fā)現(xiàn)的一種CD4+T淋巴細(xì)胞亞型，具有很強(qiáng)的促炎作用，與多種自身免疫病的發(fā)生發(fā)展有

3、關(guān)。研究證實(shí) Th17細(xì)胞發(fā)揮促AS作用。泡沫細(xì)胞是AS形成的重要病理學(xué)基礎(chǔ)，氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）可促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成，與AS的發(fā)生密切相關(guān)。本研究通過復(fù)制AS模型，分析Th9/IL-9的表達(dá)變化及其與Th17/IL-17、ox-LDL的相關(guān)性，并通過體內(nèi)干預(yù)實(shí)驗(yàn)與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確Th9/IL-9在AS進(jìn)程中的作用，并初步探討其機(jī)制，為防治AS提供新的靶點(diǎn)。<

4、br>　　目的：探討CD4+IL-9+T細(xì)胞（Th9）和IL-9在ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型中表達(dá)變化及意義，并初步探討其機(jī)制。
　　方法：（1）高脂喂養(yǎng)復(fù)制ApoE-/-小鼠AS模型，通過檢測各種指標(biāo)分析Th9/IL-9在實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程中的作用和意義。①48只雄性8周齡 ApoE-/-小鼠高脂飼料喂養(yǎng)，同周齡C57BL/6對照小鼠普通飼料喂養(yǎng)，分別飼養(yǎng)0周（0w）、4w、12w和24w后處死；②分別留取不同周齡小

5、鼠血清檢測血脂的變化：③取不同周齡小鼠的主動(dòng)脈制備石蠟切片，HE染色觀察小鼠主動(dòng)脈斑塊形成情況；④流式細(xì)胞術(shù)檢測不同周齡小鼠脾臟 Th9細(xì)胞和Th17細(xì)胞表達(dá)率的變化；⑤酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immune-sorbent assay，ELISA）法檢測不同周齡小鼠血清IL-9、 IL-17和 ox-LDL濃度變化；⑥逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain r

6、ecation，RT-PCR)法檢測不同周齡小鼠的脾臟和主動(dòng)脈斑塊中PU.1和RORγt mRNA表達(dá)水平變化。（2）通過ApoE-/-小鼠體內(nèi)干預(yù)實(shí)驗(yàn)，分析重組 IL-9（rIL-9）蛋白和 IL-9單克隆抗體（IL-9mAb）對 AS發(fā)生發(fā)展的影響。①ApoE-/-小鼠15只，隨機(jī)分為3組，分別是PBS對照組、rIL-9干預(yù)組和IL-9mAb干預(yù)組，從8周齡開始尾靜脈注射，每周一次，連續(xù)12周；②HE染色檢測主動(dòng)脈斑塊大小，ELIS

7、A法檢測血清IL-9濃度。（3）泡沫細(xì)胞誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)探討Th9/IL-9在AS進(jìn)程中的作用機(jī)制。①收集C57BL/6小鼠腹腔巨噬細(xì)胞并貼壁培養(yǎng)；②將腹腔巨噬細(xì)胞分為3組，分別是對照組、ox-LDL誘導(dǎo)組和rIL-9干預(yù)組，培養(yǎng)3天后進(jìn)行油紅染色，觀察泡沫細(xì)胞形成情況。
　　結(jié)果：（1）血脂檢測顯示隨著飼養(yǎng)時(shí)間延長，ApoE-/-小鼠總膽固醇（total cholesterol，TC）和甘油三酯（triglyceride，TG）水平呈升

8、高趨勢，高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）水平不斷降低，同周齡 C57BL/6小鼠血脂水平無顯著變化。ApoE-/-小鼠高脂飼養(yǎng)4w時(shí)，主動(dòng)脈僅出現(xiàn)增厚，12w時(shí)，主動(dòng)脈出現(xiàn)斑塊，24w時(shí)，斑塊面積顯著增大，與12w相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而同周齡C57BL/6小鼠在整個(gè)飼養(yǎng)過程中主動(dòng)脈并無明顯增厚或者斑塊形成。（2）高脂飼養(yǎng)4w起，ApoE-/-小鼠Th9細(xì)胞和Th17細(xì)胞表達(dá)率均

9、高于同周齡C57BL/6小鼠（P<0.01），且隨著飼養(yǎng)周齡的延長，Th9細(xì)胞和Th17細(xì)胞表達(dá)率均明顯升高。24w時(shí)，Th9細(xì)胞表達(dá)率顯著高于12w（P<0.01），而Th17細(xì)胞表達(dá)率雖然增高，但與12w比較無明顯差異。（3）高脂飼養(yǎng)4w起，ApoE-/-小鼠血清 IL-9、IL-17和ox-LDL濃度均高于同周齡C57BL/6小鼠，且隨著飼養(yǎng)周齡的延長，IL-9、IL-17和ox-LDL濃度不斷增加。24w時(shí)，IL-9濃度達(dá)最高，

10、而IL-17濃度在12w時(shí)達(dá)到最高。（4）ApoE-/-小鼠血清IL-9濃度和脾臟Th9細(xì)胞表達(dá)率與血清ox-LDL、IL-17濃度及脾臟Th17表達(dá)率均呈顯著正相關(guān)（均P<0.01）。（5）高脂飼養(yǎng)4w起，ApoE-/-小鼠脾臟和主動(dòng)脈組織中 PU.1和 RORγt的表達(dá)水平均高于同周齡C57BL/6小鼠（均P<0.01），隨著飼養(yǎng)周齡的延長，PU.1和RORγt的表達(dá)水平不斷升高。（6） ApoE-/-小鼠在進(jìn)行 rIL-9干預(yù)后，

11、其主動(dòng)脈斑塊面積、血清 IL-9濃度與PBS對照組相比均顯著增大，而在進(jìn)行IL-9mAb干預(yù)后，其主動(dòng)脈斑塊面積、血清IL-9濃度與PBS對照組相比明顯減小。（7）rIL-9干預(yù)組誘導(dǎo)生成的泡沫細(xì)胞較ox-LDL誘導(dǎo)組明顯增多。
　　結(jié)論：（1）隨著飼養(yǎng)周齡的延長，ApoE-/-小鼠動(dòng)脈斑塊形成和發(fā)展，同時(shí)Th9/IL-9和Th17/IL-17表達(dá)亦明顯升高；Th9/IL-9在AS斑塊形成的整個(gè)進(jìn)程均呈顯著增高趨勢，而Th17/I