抗Bt-Cry1Ac單克隆抗體和納米抗體的制備及其在免疫學(xué)分析中的應(yīng)用研究.pdf

1、Bt-Cry蛋白是一種十分普遍的抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因蛋白，其中Cry1Ac蛋白是一種典型的并且被廣泛研究的Bt蛋白。Bt蛋白不僅存在于很多抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因作物中，如玉米、土豆、棉花和水稻等，而且產(chǎn)量也在逐年增加。由轉(zhuǎn)基因作物引起的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)、環(huán)境問(wèn)題日益受到全球關(guān)注，轉(zhuǎn)基因食品的安全性和可靠性都令人擔(dān)憂(yōu)，因此，對(duì)產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分的監(jiān)測(cè)非常重要。Bt蛋白檢測(cè)技術(shù)中以 ELISA為主，其中最常用到的抗體為傳統(tǒng)單克隆抗體和多克隆抗體，也有部分應(yīng)用到單鏈抗體和納

2、米抗體等基因工程抗體。傳統(tǒng)抗體特異性強(qiáng)，靈敏度高，而基因工程抗體尤其是納米抗體，分子量小，穩(wěn)定性高，易于表達(dá)和改造。
　　本文以Cry1Ac蛋白為靶抗原，采用傳統(tǒng)單克隆抗體制備技術(shù)和噬菌體展示技術(shù)分別制備抗Cry1Ac單克隆抗體和納米抗體，并將其用于免疫學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1 Cry1Ac鼠單克隆抗體的制備及其在免疫學(xué)分析中的應(yīng)用
　　采用雜交瘤細(xì)胞篩選技術(shù)，將Cry1Ac蛋白免疫小鼠，取小鼠脾臟B細(xì)胞與骨髓瘤

3、細(xì)胞融合，經(jīng)3~5次亞克隆和非競(jìng)爭(zhēng)間接ELISA鑒定，最終篩選出8株抗Cry1Ac單克隆抗體；抗體疊加ELISA初步分析單克隆抗體3A5和9F10能識(shí)別不同的抗原表位；以單克隆抗體8A8為捕獲抗體，酶標(biāo)抗體9F10-HRP為檢測(cè)抗體，建立雙抗夾心ELISA，線(xiàn)性范圍0.98~30ng/mL，最低檢測(cè)限0.1ng/mL。
　　2 Cry1Ac納米抗體的研制及其免疫學(xué)分析
　　采用噬菌體展示技術(shù)，以Cry1Ac蛋白為靶分子，從駝

4、源天然納米抗體庫(kù)中淘選出3種具有不同序列的能特異性結(jié)合 Cry1Ac的噬菌體，然后提取噬菌體DNA，構(gòu)建pET25b表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化至E.coli Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、Ni柱純化獲得了3種抗 Cry1Ac納米抗體。最后采用雙抗夾心ELISA分析8種單克隆抗體與3種特異性噬菌體、3種特異性噬菌體與3種納米抗體以及3種納米抗體與8種單克隆抗體之間的匹配效果，并以最佳配對(duì)組合建立雙抗夾心ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，線(xiàn)性范圍分別