細(xì)胞代謝物的實(shí)時質(zhì)譜分析方法研究.pdf

1、在單細(xì)胞層次研究基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝物組學(xué)等已成為人們發(fā)現(xiàn)生命化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)和深入了解其分子機(jī)制的主要方向。這主要可能是因?yàn)閱渭?xì)胞層次上的分析更有利于人們對生物體內(nèi)微環(huán)境的認(rèn)識，與常規(guī)的細(xì)胞分析方法相比，單細(xì)胞層次上的分析方法更注重細(xì)胞個體間的異質(zhì)性，可以檢測到在常規(guī)分析方法中由于平均結(jié)果而被掩蓋掉的重要生物信息，而這些信息可能在疾病尤其是癌癥的早期診斷和預(yù)防方面有著非常重要的作用。同時對生物組成的最小單位和功能相對獨(dú)立的

2、單細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)成分進(jìn)行分析將有助于在細(xì)胞水平上闡明生物體尤其人體代謝和遺傳等方面的生理過程。但是由于細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的含量極低且種類具有復(fù)雜和多樣性，所以對分析方法所需樣品量、靈敏度及抗干擾能力等方面有較高的要求。目前仍沒有能夠同時完全滿足上述條件的質(zhì)譜分析方法。為了能夠?qū)渭?xì)胞實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、原位及直接實(shí)時的分析，本論文做了以下一些探索研究:
　　1、細(xì)胞是一個極為復(fù)雜的體系，在使用質(zhì)譜分析中會存在嚴(yán)重的基質(zhì)效應(yīng)，而且細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)含量均較低，檢

3、測中如果存在較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，會大大降低分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。為了能夠較好的降低或控制質(zhì)譜在檢測細(xì)胞樣品時存在的基質(zhì)效應(yīng)，本文研究離子源產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)的本質(zhì)原因及消除方法，開發(fā)了能夠克服或降低基質(zhì)效應(yīng)的基于超聲波能的離子源。該離子源主要是利用超聲波能量將分析物進(jìn)行離子化，并且采用多孔材料限制噴霧的初始液滴尺寸，大大降低了液滴的尺寸并且提高了液滴尺寸的均一性，使得該離子源能夠顯著的克服或降低分析復(fù)雜基質(zhì)時所存在的基質(zhì)效應(yīng)，成功的應(yīng)用于血清

4、、尿液及細(xì)胞培養(yǎng)液等復(fù)雜體系的研究。另外細(xì)胞代謝活動中會產(chǎn)生易揮發(fā)代謝產(chǎn)物，對其產(chǎn)生的氣體代謝物進(jìn)行檢測能夠很好的反映該細(xì)胞所處的生理狀態(tài)。但是細(xì)胞的生存環(huán)境多為水-電解質(zhì)溶液，臨近環(huán)境的氣體濕度較大，高濕度環(huán)境對常規(guī)質(zhì)譜檢測通常是一個巨大的挑戰(zhàn)。本文開發(fā)了一種基于質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的大氣壓敞開式離子源，實(shí)現(xiàn)了對對不同生長期植物釋放的氣相物質(zhì)的直接實(shí)時監(jiān)測。
　　2、細(xì)胞是維持生物體活動的最小單元，為了更好地保證生命活動，每個細(xì)胞中都含

5、有很多不同類型的化合物，所以要求分析方法要能夠同時實(shí)現(xiàn)對多種類型物質(zhì)的同時檢測。為了能夠?qū)崿F(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)全面的分析，本文建立了可以同時分析極性和非極性物質(zhì)的方法。本方法采用將能夠產(chǎn)生等離子體的大氣壓化學(xué)離子源與噴霧型離子化的多孔材料輔助的超聲波噴霧離子源進(jìn)行聯(lián)合，得到了一種等離子體增強(qiáng)型多孔材料輔助的超聲波噴霧離子源。該離子源能夠同時產(chǎn)生等離子體型和噴霧型兩種離子化模式，實(shí)現(xiàn)了對極性和非極性物質(zhì)的同時檢測，同時保留了多孔材料輔助的超聲波

6、噴霧離子源抗基質(zhì)干擾的特性。
　　3、細(xì)胞時時刻刻都在不停的運(yùn)轉(zhuǎn)，細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)成分和含量也在不斷發(fā)生變化，這就要求分析方法能夠做到對細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的實(shí)時動態(tài)監(jiān)測。為了能夠較好的實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的實(shí)時監(jiān)測，本文選用了變化較快的化學(xué)反應(yīng)作為模型，使用等離子體增強(qiáng)多孔材料輔助的超聲波噴霧離子源質(zhì)譜實(shí)現(xiàn)了對化學(xué)反應(yīng)過程的在線監(jiān)測。利用等離子體增強(qiáng)多孔材料輔助的超聲波噴霧離子源實(shí)現(xiàn)了氮參雜石墨烯催化的對硝基苯酚和硼氫化鈉氧化還原反應(yīng)的在線監(jiān)測。

7、監(jiān)測到了在反應(yīng)過程中反應(yīng)物、中間體以及產(chǎn)物隨時間的變化，并通過氘代實(shí)驗(yàn)證明該反應(yīng)中還原過程的氫來自于水中的氫正離子，推測出了該反應(yīng)的反應(yīng)路徑，成功的驗(yàn)證了該方法可以用于物質(zhì)組成和濃度均發(fā)生變化的復(fù)雜體系的原位實(shí)時監(jiān)測的能力。
　　4、為了能夠準(zhǔn)確的知道取樣的細(xì)胞位置，并且能夠同時滿足以上三個條件，搭建了基于感應(yīng)納升電噴霧離子化質(zhì)譜與膜片鉗取樣技術(shù)結(jié)合的工作平臺，實(shí)現(xiàn)了直接對哺乳動物單個細(xì)胞內(nèi)液中化學(xué)物質(zhì)的分析。首先使用帶有微操裝置

8、的生物顯微鏡平臺將單個細(xì)胞內(nèi)液抽入納升電噴霧離子源的噴針中，其次將該噴針放到感應(yīng)納升電噴霧離子源裝置中，然后采用200 Hz，4 kV的感應(yīng)電壓將分析物進(jìn)行離子化。成功的利用質(zhì)譜分析技術(shù)檢測出了人胚腎細(xì)胞和腦片單個神經(jīng)元中一些重要代謝產(chǎn)物。本文還采用四氯化碳構(gòu)建了人胚腎細(xì)胞的受損模型，成功的在單細(xì)胞層次檢測到不同受損程度的細(xì)胞內(nèi)液中代謝物的變化，且發(fā)現(xiàn)其中肌酸酐的變化趨勢與臨床診斷結(jié)果相符。另外本文通過膜片鉗與感應(yīng)納升電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用方式