樹(shù)枝狀聚合物前藥聯(lián)合雙光子光動(dòng)力療法的抗癌初探.pdf

1、如今，腫瘤的發(fā)生率與日俱增，已成為威脅人類(lèi)健康和生命的第一殺手，其治療和研究一直是醫(yī)藥界的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。腫瘤治療的方法包括手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)治療，很大程度上仍以化學(xué)治療（簡(jiǎn)稱(chēng)化療）為主。目前化療在臨床治療中存在毒副作用大、損害患者免疫系統(tǒng)等缺點(diǎn)。光動(dòng)力療法（photodynamic therapy, PDT）是近年來(lái)推出的一種治療腫瘤的新手段，有損傷小、局部直接治療等優(yōu)點(diǎn)，可選擇性地殺傷淺表腫瘤，而不傷及正常組織。但是，PDT也存在

2、光敏劑對(duì)腫瘤組織的選擇性差，激發(fā)光穿透力弱以致治療深度不夠等缺點(diǎn)，限制了PDT的應(yīng)用范圍。基于此，本課題構(gòu)建了一種安全且能裝載化療藥物、雙光子化合物及光敏劑的前藥型靶向納米給藥系統(tǒng)，擬提高化療藥和光敏劑的選擇性，延伸藥物穿透組織的深度，使化療與PDT有效結(jié)合，增強(qiáng)腫瘤的治療效果。
　　本研究分為三個(gè)部分：第一部分，樹(shù)枝狀聚合物前藥和納米粒的合成、制備及表征。采取可逆加成-斷裂片段轉(zhuǎn)移（reversible addition-fra

3、gmentation chain transfer, RAFT）聚合反應(yīng)合成樹(shù)枝狀聚合物前藥（POEGMA-GFLG-PTX），用高效液相色譜法測(cè)定聚合物中PTX的含量，用體積排阻色譜法（size exclusion chromatograph, SEC）測(cè)定聚合物的分子量；采用薄膜水化法制備載藥納米粒；納米粒的表征：用紫外分光光度法和熒光分光光度法定量納米粒中物理包埋的 T1和 PPa；采用透射電子顯微鏡（transmission e

4、lectron microscopy, TEM）和納米粒度及電位分析儀觀察、測(cè)定納米粒的形態(tài)、粒徑及穩(wěn)定性；采用芘熒光探針?lè)y(cè)定聚合物的臨界膠束濃度（critical nanopartical concentration, CMC）；采用透析法考察共同載藥納米粒的酶敏性和體外釋放度；用雙光子誘導(dǎo)熒光法，測(cè)定雙光子吸收截面積。結(jié)果：成功合成了POEGMA-GFLG-PTX，PTX在聚合物中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.0％（w/w），聚合物分子量為26

5、4.0 kDa；根據(jù)特征吸收峰證明T1和PPa被共同載入納米粒，載藥納米粒制備成功；納米粒形態(tài)近似球形，粒徑為164.2±2.1 nm，且36 h內(nèi)納米粒的粒徑較穩(wěn)定；聚合物的CMC為4.9×10-3 mg/mL；納米粒的釋放與酶的存在相關(guān)，36 h內(nèi)的累計(jì)釋放率均達(dá)到90?以上；納米粒中T1在808 nm處的雙光子吸收截面積為：σ=293.7φ/GM。第二部分，載藥納米粒的體外藥效考察。采用光漂白法檢測(cè)單線(xiàn)態(tài)氧的產(chǎn)生；采用雙光子共聚焦

6、顯微鏡考察4T1細(xì)胞對(duì)納米粒的攝取，加入內(nèi)吞抑制劑考察細(xì)胞內(nèi)吞行為；采用CCK-8法檢測(cè)載藥納米粒對(duì)4T1細(xì)胞的暗/光毒性；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)載藥納米粒對(duì)4T1細(xì)胞的凋亡率；采用活性氧檢測(cè)試劑盒（2,7-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate, DCHF-DA）檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平；采用雙光子共聚焦顯微鏡實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)雙光子光動(dòng)力療法下細(xì)胞形態(tài)的變化

7、。Lambda Stack掃描并測(cè)定共同載藥納米粒（DLNps）的熒光發(fā)射圖譜。結(jié)果：載藥納米粒在PBS溶液中能夠?qū)崿F(xiàn)長(zhǎng)波長(zhǎng)激發(fā)產(chǎn)生單線(xiàn)態(tài)氧。4T1細(xì)胞可以攝取納米粒，且通過(guò)網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)涵體-溶酶體途徑攝取藥物；在無(wú)光照下，T1（10.7μg/mL）與PPa（8.3μg/mL）對(duì)4T1細(xì)胞的存活率無(wú)明顯影響，載藥納米粒BNps、TPNps、PSNps、DLNps的IC50值分別是：12.8μg/mL、14.1μg/mL、1

8、1.4μg/mL、11.1μg/mL；在光照條件下，細(xì)胞存活率隨著光照時(shí)間和強(qiáng)度的增加而下降；通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，PDT誘導(dǎo)細(xì)胞在3分鐘內(nèi)凋亡率達(dá)到92.7%；4T1細(xì)胞內(nèi)，T1和PPa的吸收光譜有較大部分的重疊；在雙光子共聚焦顯微鏡光照下，細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著增加，并實(shí)時(shí)觀察到細(xì)胞形態(tài)的破壞。第三部分，小鼠皮下乳腺癌模型的建立及藥效考察。采用4T1細(xì)胞構(gòu)建小鼠皮下乳腺癌模型，利用小動(dòng)物活體成像儀考察36 h內(nèi)載藥納米粒對(duì)腫瘤組織的靶向