甜味蛋白monellin分子的理性設(shè)計(jì)及改造.pdf

1、甜味蛋白monellin（莫內(nèi)林）由于自身具有高甜味（約為蔗糖的3000倍）和低卡路里的特點(diǎn)，因此在食品應(yīng)用方面有較強(qiáng)的潛在價(jià)值。但是天然狀態(tài)下甜味蛋白monellin的耐熱穩(wěn)定性及耐酸堿穩(wěn)定性較弱，使得monellin在食品應(yīng)用方面受到了極大的限制。
　　本研究中，我們首先根據(jù)甜味蛋白monellin的氨基酸序列(GenBank:AFF58925.1)，結(jié)合細(xì)菌密碼子的偏好性，人工設(shè)計(jì)合成單鏈monellin基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒并

2、將其導(dǎo)入到大腸桿菌內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，然后通過(guò)鎳親和層析以及分子篩層析分離純化獲得較純蛋白收集液。純化后的蛋白液進(jìn)行透析實(shí)驗(yàn)，然后通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)對(duì)其甜味閾值及熱穩(wěn)定進(jìn)行研究。進(jìn)一步利用凝血酶對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行酶切實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證組氨酸標(biāo)簽并不會(huì)對(duì)甜味蛋白產(chǎn)生影響。
　　我們針對(duì)甜味蛋白monellin熱穩(wěn)定性較低這一特性，通過(guò)序列和結(jié)構(gòu)分析及基因突變的手段改變蛋白上不同位點(diǎn)的氨基酸，實(shí)現(xiàn)蛋白熱穩(wěn)性提高且甜度不會(huì)下降的目的。在這些突變中效果最為顯著的為

3、突變體E23A和C41A，前者是保持甜味閾值不升高且熱穩(wěn)定性相較于單鏈甜味蛋白monellin顯著提高，可在85℃溫度下保持30min不變性，后者則是熱穩(wěn)定性有較小的提升，且甜味閾值降低，比野生型甜味蛋白monellin甜度還要高。此外，我們還發(fā)現(xiàn)能夠提高蛋白熱穩(wěn)定性的突變體的氨基酸位點(diǎn)分布于α-螺旋的兩端。經(jīng)過(guò)本研究，我們證明可以通過(guò)基因突變手段來(lái)提高甜味蛋白monellin的穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)甜味蛋白monellin的工業(yè)化生產(chǎn)，為人類(lèi)提