高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)花生中6種真菌毒素的方法及應(yīng)用研究.pdf

1、[目的]
　　隨著人類社會(huì)城市化與工業(yè)化進(jìn)程加速，對(duì)環(huán)境所造成的污染也越來越嚴(yán)重，各類食品安全事件不斷發(fā)生，人們對(duì)食品安全問題也越來越關(guān)注?；ㄉ俏覈?guó)最重要的農(nóng)作物之一，具有控制食欲、穩(wěn)定血糖、利于減鹽、保持心臟健康，可減少冠心病、結(jié)腸癌患病風(fēng)險(xiǎn)等的營(yíng)養(yǎng)功效，真菌毒素的污染是影響花生及其制品產(chǎn)量和質(zhì)量的一個(gè)重要因素，真菌毒素污染可發(fā)生于花生種植、收獲前后及運(yùn)輸加工等各個(gè)階段。本研究的主要目的是建立一種快速、簡(jiǎn)便、高效的同時(shí)檢測(cè)花生

2、中的黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素等6種毒素的液液分散式微萃取凈化、富集，高效液相色譜-熒光檢測(cè)器檢測(cè)的方法，將其應(yīng)用于花生樣品中這6種真菌毒素的檢測(cè)分析中，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果對(duì)花生收獲前后的6種真菌毒素的含量進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析，調(diào)查毒素可能的污染來源，為針對(duì)性地采取措施預(yù)防花生中真菌毒素的污染提供科學(xué)有力的依據(jù)，為國(guó)家相關(guān)部門制定相應(yīng)措施提供一定的數(shù)據(jù)參考。
　　[方法]
　　1.樣品的采集
　　200份花生樣品于201

3、4年9月至2015年1月自山東省臨沂市的沂水縣、臨沭縣、莒南縣、平邑縣和沂南縣等花生主要產(chǎn)地之一進(jìn)行采集。每縣隨機(jī)抽取10戶農(nóng)戶作為一個(gè)采樣點(diǎn)，每個(gè)采樣點(diǎn)一次采集0.5kg花生樣品，采樣時(shí)間為收獲前1～2周、收獲時(shí)、收獲后晾干一個(gè)月以及收獲后儲(chǔ)藏3個(gè)月。采集的樣品被充分研磨混勻，-20℃冰箱保存。
　　2.真菌毒素的檢測(cè)
　　2.1.樣品提取
　　稱取10.0g充分混勻的花生樣品置于具塞錐形瓶中，加入50.0 mL甲醇

4、水溶液（V/V80∶20），振搖混勻，超聲提取30min，量取5.00 ml提取液至10 ml玻璃離心管中，5000 rpm離心5 min，上清液供進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)使用。
　　2.2.液液分散式微萃取
　　取200μL三氯甲烷（用作萃取劑）加入1.00 mL上述離心后的上清液（用作分散劑），充分混勻。取10 ml玻璃離心管加入5 mL去離子水（水相pH調(diào)整為3），用1.5 mL玻璃注射器將混合物迅速注入裝有去離子水的離心管中，萃取

5、劑、分散劑與水相充分混合，迅速形成云霧狀乳濁液，樣品中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、ZEN和OTA被迅速萃取至三氯甲烷中。將混合溶液渦旋振蕩30s，經(jīng)5000rpm離心5 min后，三氯甲烷密度較大沉入離心管底部，去除上層水相液體，剩余液體經(jīng)溫和氮?dú)獯蹈珊?，殘留物供柱前衍生化用?br>　　2.3.柱前衍生化
　　取200μL正己烷和100μL三氟乙酸加入到上述盛有殘留物的離心管中，渦旋振蕩混勻30 s后，40℃水浴條件

6、下衍生15 min。混合溶液經(jīng)溫和氮?dú)獯涤诤?，殘留物?00μL乙腈復(fù)溶，渦旋混勻后供高效液相色譜儀分離檢測(cè)。
　　2.4.高效液相色譜條件
　　花生樣品中黃曲霉毒素、赭曲霉毒素和玉米赤霉烯酮等6種真菌毒素的分離使用高效液相色譜儀，用熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。采用Inertsil(@) ODS-3 C18色譜柱分離，柱溫30℃，流動(dòng)相A為:1％乙酸水溶液和流動(dòng)相B為:乙腈。梯度洗脫程序?yàn)?泵B的濃度在0到14.0 min保持為30

7、％;從14.0到24.0 min，泵B的濃度逐漸上升到70％;從24.0到35.0 min，泵B的濃度保持在70％;最后，從35.0到40.0min,泵B濃度降回到30％。
　　激發(fā)波長(zhǎng)(Ex)和發(fā)射波長(zhǎng)(Em)分別設(shè)定為各真菌毒素的最佳檢測(cè)波長(zhǎng)，其變波長(zhǎng)程序?yàn)?從0到20.0 min，激發(fā)波長(zhǎng)(Ex)和發(fā)射波長(zhǎng)(Em)分別為360和440 nm;從20.0到29.8 min，激發(fā)波長(zhǎng)(Ex)和發(fā)射波長(zhǎng)(Em)分別為274和460

8、 nm;從29.8到40.0 min，激發(fā)波長(zhǎng)(Ex)和發(fā)射波長(zhǎng)(Em)分別為333和477 nm。進(jìn)樣量為10μL，流速為1.0 ml/min。
　　[結(jié)果]
　　1.在本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化好的實(shí)驗(yàn)條件下，各真菌毒素的線性范圍為:AFB1,AFG1和OTA:1～100 ng/mL; AFB2和AFG2:0.3～30 ng/mL; ZEN:5～1000 ng/mL.相關(guān)系數(shù)(R2)在0.9969～0.9997之間。檢出限分別為:0.1

9、0，0.10,0.30，0.03，0.03和1.0μg/kg。平均加標(biāo)回收率范圍在83.1％到99.5％之間，RSD＜10％(n=6)。
　　2.在本實(shí)驗(yàn)研究的200個(gè)花生樣品中污染的的主要真菌毒素是ZEN、AFB1和AFG1。半數(shù)左右的花生樣品被黃曲霉毒素所污染，花生收獲前后的每個(gè)階段均檢出了AFs，檢出率為34％～58％，含量范圍為0.11～3.26μg/kg，ZEN的檢出率為40％(20/50)～56％(28/50)，平均濃

10、度為19.2～53.9g/kg; OTA僅在1個(gè)收獲前和2個(gè)晾干后一個(gè)月的花生樣品中有檢出，濃度含量分別為:0.95、0.83和9.27μg/kg。
　　3.樣品中AFs的含量均未超過歐盟和我國(guó)規(guī)定的花生及制品中AFs的含量限值4.0μg/kg和20μg/kg。AFB1是AFs中檢出率和含量最高的，且在收獲后干燥1個(gè)月和儲(chǔ)存3個(gè)月的樣品中各有一個(gè)花生樣品中AFB1的含量為2.24和3.26μg/kg，超出了歐盟規(guī)定的含量上限2.0

11、μg/kg，但未超過我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)5.0μg/kg。四個(gè)時(shí)期的花生樣品中AFG1的檢出率為10％(5/50)～20％(10/50)，平均含量范圍為0.39～0.47μg/kg。AFB2和AFG2的檢出較少"僅在收獲后保存3個(gè)月后的一個(gè)花生樣品中檢出AFB2，其含量為0.27μg/kg;AFG2在所有樣品中均未檢出。
　　4.每個(gè)時(shí)期花生樣品中有1～3個(gè)樣品中ZEN的含量超過了歐盟標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的谷物及其制品中的含量限值100μg/kg，

12、超標(biāo)率為3％，ZEN含量最高樣品中的濃度為323μg/kg，按照我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的小麥及玉米及其制品中玉米赤霉烯酮的含量限值為60μg/kg，該研究中ZEN的超標(biāo)率為5.5％。
　　5.經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，四期花生樣品中AFB1、AFG1、總AFs和ZEN的濃度含量和檢出率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。各期花生樣品中AFs和AFB1的最大值呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)。
　　[結(jié)論]
　　1.研究建立的液液分散式微萃取-高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)花生樣

13、品中AFs、ZEN和OTA等6種真菌毒素的分析方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、準(zhǔn)確度好，適用于花生樣品中6種真菌毒素的同時(shí)檢測(cè)。
　　2.研究結(jié)果中OTA的檢出率明顯低于AFB1、AFG1和ZEN，但花生樣品中 ZEN的污染較為嚴(yán)重。
　　3.本研究對(duì)臨沂市花生樣品在收獲前、收獲時(shí)、收獲后干燥1個(gè)月和收獲后貯存3個(gè)月等4個(gè)時(shí)期的6種真菌毒素污染情況的動(dòng)態(tài)分析結(jié)果顯示:四期花生樣品中AFB1、AFG1、總AFs和ZEN的濃度含量和檢