新型噬菌體壓電傳感器快速檢測結核分枝桿菌的機理及其藥敏應用效果的研究.pdf

1、結核病是目前單因素引起發(fā)病率和死亡率最高的疾病。全球有三分之一的人群感染結核分枝桿菌，每年新增800萬結核病人，有200萬人死于結核病。世界衛(wèi)生組織于1993年宣布:全球處于結核病緊急狀態(tài)。引起結核病再次大流行的原因之一是不合理用藥導致的耐藥菌株的出現(xiàn)。為有效執(zhí)行DOTS(DirectlyObservedTreatment，Short-Course)策略，快速檢測結核分枝桿菌和正確選擇抗生素治療成為防治結核病的關鍵。
　　利用串聯(lián)

2、式壓電石英傳感器對環(huán)境電參數(shù)響應靈敏的特點，將其應用于微生物生長狀態(tài)監(jiān)測中，及早得到微生物的生長信息。用串聯(lián)式壓電傳感器，分析培養(yǎng)基不同成分對微生物生長壓電信號的影響;用單因素分析方法，分析不同成分對恥垢分枝桿菌和結核分枝桿菌生長曲線的影響。將M7H9培養(yǎng)基中成分的作用分為緩沖作用、合成代謝作用、生長促進因子作用，構建分枝桿菌壓電檢測體系。對壓電頻移曲線進行分類，將壓電頻移信號產(chǎn)生的物質基礎分為分解代謝所分泌電導成分和合成代謝所吸收電導

3、成分兩種類型，分別產(chǎn)生向下的頻移曲線和向上的頻移曲線，提升對串聯(lián)式壓電微生物傳感器頻移信號的理論認識。
　　用噬菌體成斑率為指標，研究噬菌體在環(huán)境中穩(wěn)定的條件，保證噬菌體的感染效率;研究噬菌體最佳的滅活方法，減少實驗過程出現(xiàn)假陽性。分析鈣鎂濃度對噬菌體吸附、頓挫感染的影響，得出最佳的鈣離子濃度、殺毒劑硫酸亞鐵胺濃度。用一步生長曲線研究噬菌體D29與恥垢分枝桿菌作用的特性，分析影響噬菌體生物放大作用的外部環(huán)境因素，優(yōu)化出最適合結核分

4、枝桿菌快速檢測的培養(yǎng)基配方。綜合考慮噬菌體的穩(wěn)定條件、滅活條件、一步生長曲線的最優(yōu)條件和恥垢分枝桿菌在M7H9培養(yǎng)基中壓電信號的影響因素，選擇適合構建噬菌體生物放大的壓電傳感器檢測培養(yǎng)體系。
　　結核分枝桿菌和恥垢分枝桿菌能被噬菌體D29感染，保護菌體內的噬菌體D29不被硫酸亞鐵殺滅。樣品中的結核分枝桿菌被作為載體，將加在樣品處理液中的噬菌體D29轉移到檢測池。在檢測池中，噬菌體D29裂解結核分枝桿菌釋放子代噬菌體，子代噬菌體感染

5、恥垢分枝桿菌，經(jīng)歷快速的感染、復制、裂解的循環(huán)過程。這個循環(huán)過程構成噬菌體鏈式生物放大反應，最終得到完全抑制恥垢分枝桿菌生長的結果。樣品中結核分枝桿菌的濃度不同，轉移到檢測池中的噬菌體D29的也濃度不同，完全抑制恥垢分枝桿菌生長所需的循環(huán)次數(shù)不同，最終導致檢測池中恥垢分枝桿菌生長程度不同。當樣品中沒有結核分枝桿菌充當噬菌體的載體時，則無噬菌體被轉移到檢測池中，恥垢分枝桿菌的生長不受噬菌體抑制。恥垢分枝桿菌在生長過程中，利用培養(yǎng)基中的電導

6、成分，引起壓電傳感器產(chǎn)生頻移響應信號。不同濃度的結核分枝桿菌引起不同強度的壓電頻移響應信號。
　　在液體培養(yǎng)基中，充分發(fā)揮噬菌體的鏈式放大作用，提高檢測方法靈敏度。應用壓電傳感器對電參數(shù)的靈敏響應，提高檢測方法的靈敏度。通過噬菌體D29橋梁作用，將慢速生長的結核分枝桿菌檢測，轉換成快速生長的恥垢分枝桿菌的檢測，大大提高檢測速度。噬菌體對結核分枝桿菌的裂解作用，可降低實驗風險，安全可靠。恥垢分枝桿菌檢測所需要培養(yǎng)基和儀器要求低，成本

7、低廉。用數(shù)學模型分析檢出時間與溶液中噬菌體濃度的關系，得出檢測時間與溶液中1-102pfu/mL噬菌體D29濃度成線性的結果。用雙盲對照的原則研究樣本處理對檢測方法的影響，得出正確的樣本處理方法，保證結果的準確度，避免假陽性和假陰性。該方法可以檢測102cfu/mL的結核分枝桿菌，檢測時間縮短到30小時，具有臨床診斷實用價值。噬菌體放大多通道壓電傳感器法(PA-MSPQC)與BactecMGIT960法的統(tǒng)計學比較結果，得出兩者檢測臨床

8、樣本的靈敏度和特異度一致。但PA-MSPQC法檢測時間只需30小時，優(yōu)于培養(yǎng)法。PA-MSPQC法還可以通過提高噬菌體感染效率，進一步提高方法的靈敏度。
　　防止耐藥結核分枝桿菌的出現(xiàn)是控制結核病的關鍵措施，實現(xiàn)結核分枝桿菌菌株耐藥的快速檢測，對合理用藥和防止耐藥菌株的出現(xiàn)有非常重要的意義。我們根據(jù)噬菌體只能感染活的結核分枝桿菌的特點，將PA-MSPQC法應用于結核分枝桿菌耐藥檢測。建立PA-MSPQC法耐藥結果的頻移標準，根據(jù)實

9、驗條件和比例法耐藥的判別標準，對利福平、異煙肼和乙胺丁醇三種藥物，當恥垢分枝桿菌生長引起的頻移小于121Hz時，認為菌株對藥物耐受;對鏈霉素藥物，當恥垢分枝桿菌引起的壓電頻移小于92Hz時，判定菌株對鏈霉素耐藥。將雙盲實驗中，PA-MSPQC法所得的結果與MGIT960法所得結果進行統(tǒng)計學分析，得出PA-MSPQC法與MGIT960法沒有統(tǒng)計學差異，能準確檢測臨床結核分枝桿菌菌株對利福平、異煙肼、乙胺丁醇和鏈霉素等一線抗結核藥物的耐受情

10、況。由于PA-MSPQC法能快速報告實驗結果，可以替代傳統(tǒng)的培養(yǎng)法用于臨床結核分枝桿菌菌株的耐藥實驗。但是PA-MSPQC同樣存在噬菌體感染效率的問題，有可能將未感染噬菌體的結核分枝桿菌當成耐藥菌株，影響方法的準確度。因此，優(yōu)化培養(yǎng)基成分是提高檢測方法靈敏度，提高耐藥實驗準確度的關鍵。
　　為建立微生物快速傳感檢測新方法，我們使用石墨烯新材料和核酸序列代替適配體進行初步實驗。用化學氣相沉積法在銅箔表面制備大面積石墨烯，用拉曼光譜分

11、析在不同氣體條件下形成石墨烯的質量，研究氫氣流量、溫度、基底材料對石墨烯質量的影響，直接制備出可用于電極分析的大面積單層石墨烯。用電化學阻抗譜和循環(huán)伏安法研究核酸序列在石墨烯電表面吸附和解離的條件，得出鈉的濃度在100mmol/L、鎂的濃度在5mmol/L，核酸序列通過p-p堆集作用而吸附，電極表面電子傳遞阻力增大;在鈣、鎂離子的存在條件下，吸附的核酸序列與互補序列作用解離，電極表面電子傳遞阻力減小;電極表面的電子傳遞阻力的擬合分析得出