基于特定位點廣泛突變的聚合酶體外表型分析.pdf

1、核苷（酸）類似物應(yīng)用于慢性乙肝治療時常發(fā)生耐藥。聚合酶特定位點突變與耐藥有直接關(guān)系。在核苷類似物耐藥相關(guān)研究中，對突變熱點進行廣泛突變表型分析有助于理解基因型與表型的相互關(guān)系?，F(xiàn)有基于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的廣泛突變分析方法存在一些不足。本文中，我們建立了一種聚合酶特定位點廣泛突變表型分析的新策略，該方法結(jié)合了簡并引物隨機突變方法以及聚合酶反式互補策略。以拉米夫定（lamivudine，LAM）耐藥位點rt204為例，我們檢驗了該策略的可行性與實用性

2、。
　　目的：
　　通過結(jié)合簡并引物隨機突變方法以及聚合酶反式互補策略，構(gòu)建一種聚合酶特定位點廣泛突變表型分析的新策略。
　　方法：
　　1.通過簡并引物隨機突變和片斷替換反應(yīng)（Fragment Substitution Reaction,FSR），構(gòu)建RT區(qū)位點特異性的多種突變;
　　2.通過慢病毒包裝混合質(zhì)粒，將含特定位點多種突變引入293HBV-pol-穩(wěn)定細胞系；通過反式互補，拯救293HBV-po

3、l-中HBV復(fù)制，篩選獲得穩(wěn)定復(fù)制的單克隆細胞系進行體外耐藥表型分析；
　　3.以rt204（LAM耐藥位點）為例，構(gòu)建包含rt204位點的隨機突變，經(jīng)慢病毒包裝后感染293HBV-pol-穩(wěn)定細胞系，經(jīng)抗性篩選及基因組DNA測序獲得包含特定突變的單克隆細胞系，進行體外藥物敏感性分析。
　　結(jié)果：
　　簡并引物隨機突變可有效地獲得含RT區(qū)特定位點的多種突變形式，我們通過隨機引物Rpol204引入了rt204位點兩個堿基

4、的隨機突變（NNT），F(xiàn)SR替換質(zhì)粒pLentipol-D相應(yīng)區(qū)段，構(gòu)建了慢病毒載體HBV重組表達質(zhì)粒（野生型和突變型），經(jīng)過一次聚合酶鏈式反應(yīng)獲得了rt204位點的野生型及14種突變型;經(jīng)抗性篩選及基因組測序獲得了6種單克隆細胞系用于耐藥檢測；
　　與野生型相比，突變型有明顯復(fù)制缺陷，rtM204I相對于野生型復(fù)制水平為3.039%，rt204N,RT204K與rt204I復(fù)制水平接近;部分突變類型復(fù)制能力顯著降低，如rt204

5、T,rt204R,分別為0.102%，0.005%；經(jīng)LAM處理后，野生型復(fù)制水平下降了7倍左右（6.842±0.983），rt204I/T復(fù)制水平降低1倍左右（1.201±0.031，1.174±0.146），rt204N對LAM敏感性較高，經(jīng)藥物處理后，復(fù)制能力降低了近10倍，rt204K/R對LAM中度敏感。
　　結(jié)論：
　　我們成功建立了一種新的突變表型分析方法，其特點有：1.通過一輪PCR及FSR，獲得特定位點廣泛

6、突變；2.通過一次慢病毒包裝，獲得含多種突變形式的慢病毒池；3.通過反式互補的方式獲得含聚合酶突變的穩(wěn)定細胞系用于藥物敏感性分析。該策略較傳統(tǒng)方法而言，具有簡便，高效，變異率低等特點。利用該策略，我們成功構(gòu)建了rt204位點的多種突變形式，證實了各突變型較野生型有明顯功能缺陷。在使用LAM處理的情況下，rt204I/T占競爭優(yōu)勢。這一結(jié)果符合既往文獻報道，且能合理解釋臨床相關(guān)耐藥現(xiàn)象。以上結(jié)果提示該方法具有可行性。我們建立的這一實驗策略