依賴于環(huán)指蛋白8的人DNA聚合酶δ體外泛素化反應(yīng)探討.pdf

1、在真核生物B-家族三種主要DNA聚合酶（Polα、Polδ和Polε）中，Polδ是最重要的一種復(fù)制性聚合酶，除了在染色體 DN A復(fù)制過程中起重要作用外，它還參與多種形式的DN A損傷修復(fù)過程，在維持細(xì)胞周期的正常調(diào)節(jié)以保證基因組結(jié)構(gòu)的完整性和遺傳穩(wěn)定性方面具有特殊的重要意義。人源 DN A聚合酶δ是由四個(gè)亞基組成的異源四聚體：催化大亞基p125、小亞基p50、以及另外兩個(gè)輔助亞基p68和p12。前期的研究發(fā)現(xiàn)，在損傷試劑處理或射線誘

2、導(dǎo)而引起 DN A損傷的情況下，最小亞基p12在ATR/Chk1通路調(diào)控下以泛素化依賴（ubiquitinylation-dependent）的形式經(jīng)蛋白酶體降解，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Polδ由原來的四聚體形式Po lδ4轉(zhuǎn)換為三聚體Po lδ3以應(yīng)對(duì)DN A損傷，并可能在隨后的修復(fù)過程中起著重要作用。
　　研究表明，p12的降解可能受到多種E3介導(dǎo)的多泛素化途徑的調(diào)控，但截止到目前，僅鑒定出兩種E3連接酶，環(huán)指蛋白8（Ring Fin

3、ger Protein8, RNF8）和CRL4Cdt2，它們均介導(dǎo)了以 p12為靶標(biāo)的多泛素化修飾。有報(bào)道指出，p68亞基在體內(nèi)也能夠被泛素化和類泛素化修飾，但在應(yīng)對(duì)DNA損傷的過程中，Polδ究竟有多少亞基、具體哪個(gè)亞基、被何種E2/E3系統(tǒng)所介導(dǎo)、是發(fā)生多泛素還是單泛素修飾等的詳細(xì)機(jī)制均不是很清楚。
　　幾乎所有主要的DN A修復(fù)途徑、損傷避免機(jī)制和細(xì)胞周期檢查點(diǎn)響應(yīng)等過程都或多或少的受到泛素化和（或）類泛素化 SUMO修飾

4、途徑的調(diào)控。泛素化和 SUMO參與多種 DNA的修復(fù)過程，如跨損傷合成（Translesion Synthesis）、核苷酸切除（Nucleotide Excision）、同源重組（Homologous Recombination）等?；诜核鼗揎椩诟鞣NDNA損傷修復(fù)途徑中的重要作用，本論文研究擬對(duì)Polδ的四個(gè)亞基分別進(jìn)行體外泛素化分析，為揭示Polδ的泛素化修飾在DN A損傷應(yīng)答過程中的未知功能提供參考。
　　本研究應(yīng)用昆蟲

5、-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，通過制備具 E3連接酶活性的RNF8，結(jié)合外購的多種E2綴合酶，對(duì)Po lδ的四個(gè)亞基分別進(jìn)行泛素化修飾的體外分析；同時(shí)通過外購的E2/E3系統(tǒng)-RAD6/RAD18，對(duì)Polδ各亞基也進(jìn)行了初步的泛素化體外分析。結(jié)果表明，RNF8既可介導(dǎo)p50單泛素化修飾，又可介導(dǎo)p12亞基的多泛素化修飾，但不能介導(dǎo)p125亞基的泛素化。RAD6/RAD18作為E2/E3酶，在DN A基質(zhì)的存在下，能夠介導(dǎo)p50的泛素化修飾，類似