轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化花生過敏原Ara h 2反應(yīng)體系的研究.pdf

1、花生是世界糧農(nóng)組織認(rèn)證的八大食物過敏原之一，花生可導(dǎo)致嚴(yán)重的過敏反應(yīng)，甚至危及生命，且一般不隨年齡的增長而消失。隨著人們生活水平的提高，食物過敏的問題越來越受到關(guān)注，因此也越來越多的研究致力于降低花生過敏原的致敏能力。本文以花生中主要過敏原Ara h2為研究對(duì)象，由于Ara h2是花生蛋白中重要的過敏原，因此降低Ara h2的致敏性有重要的實(shí)際意義。
　　本研究對(duì)微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（microbal transglutaminas

2、e，MTGase）與Ara h2蛋白的反應(yīng)體系中，不同條件對(duì)反應(yīng)體系的影響進(jìn)行了探究，分析了酶催化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的變化，評(píng)估了加工后Ara h2消化性及其潛在致敏性的變化。研究還將還原蛋白的交聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行分離，得到低聚物及高聚物，分析了它們的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的區(qū)別。研究的主要方法、結(jié)果及結(jié)論如下：
　　1.MTGase催化還原Ara h2產(chǎn)物在SDS-PAGE電泳上有大分子聚合物產(chǎn)生，說明蛋白發(fā)生了外交聯(lián)反應(yīng)，另外與天然Ara h2相比，酶催化

3、反應(yīng)后Ara h2單體條帶發(fā)生下移，顯示蛋白的結(jié)構(gòu)變得更加緊湊，平均粒徑減小，質(zhì)譜鑒定證實(shí) Ara h2發(fā)生了內(nèi)交聯(lián)反應(yīng)。體系中還有脫酰胺反應(yīng)發(fā)生，研究測(cè)定了MTGase催化的還前后蛋白溶液pH值的變化，發(fā)現(xiàn)溶液pH都升高，這是由于氨基脫落造成的。不論還原前后，每分子Ara h2脫落游離氨的個(gè)數(shù)均大于2，證明體系中都有脫酰胺反應(yīng)發(fā)生。因此，酶催化還原蛋白發(fā)生了三種反應(yīng)，即：外交聯(lián)反應(yīng)，內(nèi)交聯(lián)反應(yīng)，脫酰胺反應(yīng)，而酶直接催化Ara h2則僅

4、發(fā)生了內(nèi)交聯(lián)和脫酰胺反應(yīng)，未發(fā)現(xiàn)外交聯(lián)。
　　2.研究了蛋白濃度、反應(yīng)溫度及還原程度對(duì)MTGase催化Ara h2反應(yīng)體系的影響。對(duì)于MTGase催化還原Ara h2的體系，蛋白濃度較高時(shí)有利于發(fā)生外交聯(lián)反應(yīng)，低濃度有利于發(fā)生內(nèi)交聯(lián)反應(yīng)；還原則更有利于暴露谷氨酰胺殘基，有利于蛋白發(fā)生脫酰胺作用。對(duì)于MTGase催化天然Ara h2的體系，反應(yīng)不受蛋白濃度的影響，而脫酰胺作用隨著溫度的增加而增強(qiáng)。
　　3.利用質(zhì)譜結(jié)合軟件的方

5、法，確定了內(nèi)交聯(lián)的交聯(lián)位點(diǎn)，并利用圓二色譜，紫外光譜及熒光光譜檢測(cè)了酶催化反應(yīng)后Ara h2二三級(jí)結(jié)構(gòu)及表面疏水性的變化。酶催化天然蛋白只找到1對(duì)交聯(lián)片段，而還原蛋白有18對(duì)交聯(lián)片段，5個(gè)交聯(lián)位點(diǎn)，其中13個(gè)片段都包含了過敏原表位，4個(gè)交聯(lián)位點(diǎn)都在過敏原表位中，且涉及到的過敏原表位包含了Ara h210個(gè)線性表位中的5個(gè)。酶催化的天然蛋白結(jié)構(gòu)變化不明顯，而還原可以打開蛋白結(jié)構(gòu)，破壞α-螺旋結(jié)構(gòu)，α-螺旋結(jié)構(gòu)減少，同時(shí)β-折疊和無規(guī)則卷曲

6、結(jié)構(gòu)增多。還原蛋白交聯(lián)產(chǎn)物中低聚物α-螺旋含量高于聚物，且紫外吸收低于高聚物，表面疏水性高于高聚物，表明低聚物蛋白有更緊密的結(jié)構(gòu)。
　　4.采用體外模擬胃腸消化的方法分析了MTGase催化對(duì)Ara h2消化性的影響。天然Ara h2耐胃消化，但經(jīng)過胃消化后再經(jīng)腸消化，Ara h2可以被消化，在消化80min時(shí)仍有部分13kDa的片段存在。酶直接處理不改變Ara h2的胃腸消化特性，而還原和交聯(lián)處理則可以加快Ara h2的消化速率，

7、還原及交聯(lián)產(chǎn)物在經(jīng)過胃腸消化后，都可以全部被消化為小于3.5kDa的片段。且交聯(lián)產(chǎn)物中高聚物的消化速率高于低聚物的消化速率，這主要是由于低聚物中內(nèi)交聯(lián)蛋白的緊密結(jié)構(gòu)可以降低交聯(lián)產(chǎn)物的消化速率。
　　5.采用競爭抑制ELISA法檢測(cè)MTGase催化對(duì)Ara h2抗原性及潛在致敏性的影響。酶直接處理基本不改變Ara h2的IgG結(jié)合能力，還原處理可以降低IgG結(jié)合能力，但是不顯著，而還原后再交聯(lián)則可以降低Ara h2的IgG結(jié)合能力，