吸水鏈霉菌谷氨酰胺轉胺酶的活化機制和生理功能.pdf

1、谷氨酰胺轉胺酶(TransglutaminaseEC2.3.2.13簡稱TGase)是一種能夠催化蛋白質或肽分子間形成共價交聯的酶，是食品領域極為重要的酶制劑之一，同時在醫(yī)藥和紡織等工業(yè)領域具有廣闊的應用潛力。鏈霉菌谷氨酰胺轉胺酶是目前唯一商業(yè)化的能夠交聯蛋白的酶制劑。已有研究表明，茂源鏈霉菌(Streptomycesmobaraensis)中TGase以酶原(Pro—TGase)形式分泌，并受蛋白酶活化。然而有關鏈霉菌TGase活化過

2、程的機制還不清楚，鏈霉菌TGase的生理功能也未見報道。本研究室近來從土壤中篩選到一株高產谷氨酰胺轉胺酶的菌株——吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)。為進一步推動S.hygroscopicus產TGase的發(fā)酵水平，同時也為揭示更多鏈霉菌TGase的微生物學機制，本論文對S.hygroscopicus產TGase的活化過程及TGase的生理功能進行了研究。主要研究結果如下： 1.S.hygrosco

3、picus液體培養(yǎng)過程中存在從Pro—TGase到TGase的轉化過程。 TGase和Pro—TGase存在于S.hygroscopicus液體培養(yǎng)中，可通過乙醇沉淀和陽離子交換色譜(FractogelEMDSO3-柱)分離等步驟進行純化。TGase和Pro—TGase的分子量分別為40kDa和44kDa。Pro—TGase的N—端氨基酸序列為：ASGDDEEREG。 S.hygroscopicus液體培養(yǎng)中TGase以

4、酶原形式分泌并存在從酶原到成熟酶的轉化過程。S.hygroscopicus液體培養(yǎng)中Pro—TGase出現在24h，在36h達到最高，之后Pro—TGase蛋白濃度逐漸下降。隨著Pro—TGase蛋白濃度的降低，TGase蛋白濃度逐漸增加。與TGase蛋白濃度的增加相對應，TGase酶活力也開始增加。TGase酶活力在60h達到最高(2.4U/mL)，此時對應Pro—TGase的蛋白已全部轉化為成熟酶TGase的蛋白。 2.S.

5、hygroSCopicUS液體培養(yǎng)中，TGase活化蛋白酶分泌到胞外環(huán)境中并受抑制因子抑制。 TGase活化過程在無細胞上清液中發(fā)生沉默。在無細胞上清液培養(yǎng)過程中，從0至24h，Pro—TGase和TGase蛋白的濃度保持恒定，沒有發(fā)生從Pro—TGase蛋白向TGase蛋白的轉化；同時TGase活力保持恒定。 10mg/mLCTAB能夠喚醒無細胞上清液沉默的TGase活化過程。添加CTAB的無細胞上清液中Pro—TGa

6、se蛋白明顯的向TGase蛋白發(fā)生轉化，同時對應著TGase活性的顯著增加(從1.2U/mL增加到2.3U/mL)。 3.S.hygroscopicus液體培養(yǎng)中，TGase活化過程受多種蛋白酶催化調控。 通過DEAE—SepharoseF.F.柱純化獲得到了TAP樣品。純化的TAP樣品(0.03mg/mL)10μL加入到100μLPro—TGase(0.26mg/mL)中，30℃培養(yǎng)30min，TAP能夠切割Pro—T

7、Gase獲得TGase蛋白，同時可以檢測到酶活從0提高到0.92U/ml。純化的TAP為絲氨酸蛋白酶。 無細胞上清液中TGase活化過程是多種蛋白酶參與的：包括絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。10mmol/L的EDTA抑制下，無細胞上清液中TGase的酶活沒有增加，Pro—TGase和TGase的電泳條帶濃度也保持穩(wěn)定；1mmol/L的PMSF抑制下，TGase的酶活的增加以及Pro—TGase蛋白條帶向TGase蛋白條帶的轉化過程明

8、顯滯后。 4.TAPI的純化和鑒定及性質研究。 通過FractogelEMDSO3-柱和PhenylSepharose6F.F.柱對TAPI進行純化，TAPI的蛋白收率為6.36mg/L。TAPI(0.4μg)能夠抑制TAP(0.2μg)對Pro—TGase(2μg)的活化。 TAPI的N—端氨基酸序列為：GLYAATTALV，屬于SSI蛋白家族。TAPI具有表面活性，在液體培養(yǎng)中主要分布在氣液界面。5分鐘內，T

9、API(0.1mg/mL)使水的界面張力從72降到60mJ/m2。在此基礎上，提出了基于TAPI界面分布的TGase活化過程調控模型。 5.在S.hygroscopicus固體培養(yǎng)中，TGase在菌體發(fā)生分化、形成氣生菌絲時開始分泌和活化，并在形成孢子后停止活化，它可能參與了分化過程。 TGase在S.hygroscopicus營養(yǎng)菌絲的的生長階段并不分泌，而是在開始生分化形成氣生菌絲時才開分泌和活化，并在形成孢子后停止

10、活化。48h固體平板上開始出現白色的氣生菌絲的同時，檢測到胞外蛋白浸提液中TGase活性顯著提高(0.51U/plate)；144h固體平板上開始出現黑色孢子，此后已檢測不到TGase活性。Pro—TGase當量活性在48h開始出現(0.03U/plate)，之后逐漸升高并在菌體形成孢子后保持穩(wěn)定(0.65U/plate左右)。 胱胺能夠抑制S.hygroscopicus液體培養(yǎng)種純化到TGase的活性，25mmol/L的胱胺可