CS-PAA-SN-38@FA-cmCHI-PLGA納米顆粒的制備和體外生物效應(yīng)研究.pdf

1、背景：
　　癌為人類最常見(jiàn)三大疾病之一，成為人類死亡第二號(hào)殺手，死亡率居高不下。在目前癌癥的臨床治療中，化學(xué)抗癌藥物仍然發(fā)揮著極為重要的作用，但是這些化療藥物依然存在一些難以克服的毒副作用，阻礙了其的應(yīng)用。目前，為克服小分子化藥副作用，納米遞藥系統(tǒng)炙手可熱。但是，目前遞藥系統(tǒng)一般只能遞送藥物到血液或者細(xì)胞質(zhì)中，接下來(lái)藥物何去何從，便不得而知。但是許多抗癌藥物只有在進(jìn)入細(xì)胞核后，才能發(fā)揮作用，因此需要載體精準(zhǔn)遞送到靶位置。再者，抗癌

2、藥物自身破壞腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞有一定程度的損傷。
　　智能的遞送藥物分子至病灶部位，減少用藥，使得副作用降低以及減少病人痛苦。靶向遞藥系統(tǒng)(targeted drug delivery system，TDDs)，使得攜帶物具備集中定位于特定位置，繼而減少毒副作用的效應(yīng)。進(jìn)而，兼?zhèn)涠ㄎ恍罘e、微量高效等效用。研究發(fā)現(xiàn)，葉酸受體為某些腫瘤細(xì)胞過(guò)表達(dá)分子，并且葉酸分子為人體正常所需物質(zhì)。
　　目的：
　　本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞

3、本身生活環(huán)境，細(xì)胞核質(zhì)內(nèi)外特異性差別為依據(jù)，利用納米系統(tǒng)提高化學(xué)藥物的利用，另外由癌細(xì)胞特異表達(dá)葉酸受體為出發(fā)點(diǎn)，偶聯(lián)葉酸分子，使得納米系統(tǒng)于循環(huán)過(guò)程中具有靶向性。本課題組已經(jīng)成功制備粒徑較小CS/PAA顆粒，并順利包載入外層cmCHI/PLGA形成雙層納米顆粒。由于之前工作所制備納米顆粒具有被動(dòng)靶向性，主動(dòng)尋靶能力不強(qiáng)。因此在此基礎(chǔ)上，課題設(shè)計(jì)將納米顆粒具有主動(dòng)靶向的功能。制備大包小的雙層粒，并在外層顆粒材料之一cmCHI上偶聯(lián)葉酸分

4、子，使之具有靶向功能。并且，內(nèi)層載藥利用物理吸附的方法包載難溶于水的SN-38。整個(gè)納米系統(tǒng)具有逐級(jí)釋放，精準(zhǔn)遞送之功能。先是外層顆粒于酸性胞質(zhì)環(huán)境釋放，而后小顆粒入核于核內(nèi)中性環(huán)境下釋放SN-38，智能遞送藥物至作用部位。
　　方法：
　　制備表征:內(nèi)層顆粒制備采用點(diǎn)滴法，控制滴速等條件均勻化粒徑，物理吸附方式載藥SN-38。通過(guò)透射、掃描、粒徑分析表明內(nèi)層小顆粒20nm左右，為均勻光滑球體結(jié)構(gòu)。離子聯(lián)法合成葉酸連接至羧甲

5、基殼聚糖上，XRD表明葉酸與cmCHI以離子鍵結(jié)合。依據(jù)復(fù)乳化原理合成雙層顆粒，經(jīng)一系列表征證明之，并檢測(cè)其包封載藥特征。
　　生物效應(yīng):采用WST-1試劑盒檢測(cè)游離原藥、內(nèi)外層顆粒以及偶聯(lián)葉酸分子雙層顆粒的細(xì)胞毒及材料安全性。AnnexinⅤ-FITC/PI試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡，佐證材料安全性。
　　細(xì)胞攝取:熒光復(fù)染標(biāo)記示蹤內(nèi)外雙層顆粒位置及去路問(wèn)題，根據(jù)顏色疊加原理于激光共聚焦顯微鏡下觀測(cè)整個(gè)系統(tǒng)遷移情況。
　　結(jié)

6、果:
　　內(nèi)層顆粒約為20nm左右，為統(tǒng)一的光滑球型。雙層顆粒為170nm左右，均一的球型，葉酸以離子鍵結(jié)合其上。核殼納米顆粒包封達(dá)到86.91％，載藥為1.32％。透射電鏡及熒光鏡檢佐證小顆粒已經(jīng)包入大顆粒中。外層顆粒由于PLGA的酸性響應(yīng)能力，可在胞質(zhì)中的偏酸性環(huán)境下破裂釋放小顆粒。內(nèi)層顆粒中性環(huán)境及堿性條件下聚丙烯酸發(fā)生溶漲反應(yīng)，SN-38通過(guò)解吸附作用釋放。整個(gè)納米系統(tǒng)具有敏銳的pH敏感性，且葉酸分子的加入，可以引導(dǎo)納米體

7、系至癌細(xì)胞周圍。
　　WST-1顯示納米體系所選材料無(wú)毒性作用，AnnexinⅤ-FITC/PI檢測(cè)結(jié)果顯示材料引起的死亡，為溫和的凋亡方式。細(xì)胞毒結(jié)果顯示，核殼結(jié)構(gòu)納米系統(tǒng)兩株細(xì)胞A549/Hela存活力最低，高于游離藥組，且對(duì)于Hela細(xì)胞，偶聯(lián)葉酸后細(xì)胞毒性作用更顯著。
　　共聚焦顯微鏡鏡檢顯示，設(shè)計(jì)納米體系先是外層破裂釋放CS/PAA/SN-38顆粒，繼而，小顆粒擴(kuò)散入核。入核后，伴隨溶脹反應(yīng)，SN-38解吸附游離于