體外多酶催化確定乳酸合成途徑關(guān)鍵酶的研究.pdf

1、代謝途徑中的關(guān)鍵酶往往決定反應(yīng)的速度，所以關(guān)鍵酶的研究對(duì)于代謝途徑的優(yōu)化具有重要的作用，而糖酵解途徑是一切生物有機(jī)體中普遍存在的葡萄糖降解途徑，為其他代謝途徑提供中間代謝產(chǎn)物，本文研究的乳酸合成途徑包括糖酵解途徑和乳酸脫氫酶。本研究基于代謝控制分析理論提出了一種通過(guò)體外代謝途徑構(gòu)建和分析確定關(guān)鍵酶的方法，并應(yīng)用其確定乳酸高產(chǎn)菌株中的關(guān)鍵酶。首先獲得高產(chǎn)菌株的粗酶液并測(cè)定葡萄糖到乳酸合成途徑中各種蛋白的絕對(duì)濃度，進(jìn)而通過(guò)向粗酶液中分別添加

2、同等比例的各純酶對(duì)途徑進(jìn)行擾動(dòng)，并由擾動(dòng)前后的途徑通量變化計(jì)算出各酶的通量控制系數(shù)以確定途徑關(guān)鍵酶。通過(guò)上述方法本文獲得了如下主要研究結(jié)果:
　　本文成功構(gòu)建并表達(dá)了乳酸合成途徑相關(guān)蛋白，經(jīng)蛋白純化得到純酶，通過(guò)適合的酶偶聯(lián)反應(yīng)測(cè)定蛋白活性，在測(cè)定中發(fā)現(xiàn)果糖二磷酸醛縮酶(FbaA)能夠代替甘油酸磷酸激酶(Pgk)催化甘油酸-1，3-二磷酸到甘油酸-3-磷酸，且發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因有相同的操縱子，而Pgk是必需基因，所以FbaA新功能的發(fā)

3、現(xiàn)有一定的研究意義，在此基礎(chǔ)上調(diào)節(jié)底物濃度與酶濃度獲得乳酸合成途徑各蛋白的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km及比酶活，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供依據(jù);
　　通過(guò)向粗酶液中添加純酶改變催化反應(yīng)速率的方法，對(duì)乳酸高產(chǎn)菌株粗酶液中乳酸合成途徑各蛋白進(jìn)行絕對(duì)定量，確定粗酶中含有37.8mg/L葡糖激酶(Glk)，107mg/L葡萄糖磷酸異構(gòu)酶(Pgi)，78.7mg/果糖磷酸激酶(PfkA)，262.3mg/L果糖二磷酸醛縮酶(FbaA)，63.4mg/L甘油醛磷酸

4、異構(gòu)酶(TpiA)，1457mg/L甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GapA)，806mg/L甘油酸磷酸激酶(Pgk)，6.7mg/L丙酮酸激酶(PykA)，316.1mg/L乳酸脫氫酶(Ldh)，對(duì)胞內(nèi)乳酸合成途徑蛋白比例有一定認(rèn)識(shí)，通過(guò)進(jìn)一步向粗酶液中分別添加同等比例的各種純酶對(duì)途徑進(jìn)行擾動(dòng)，測(cè)定途徑達(dá)到準(zhǔn)穩(wěn)態(tài)時(shí)的通量變化，計(jì)算各酶的通量控制系數(shù)Glk為0.14，Pgi為0.47，PfkA為0.35，F(xiàn)baA為0.35，TpiA為0.27，