RNA干擾對(duì)多囊卵巢綜合征雄激素合成關(guān)鍵酶17α-羥化酶-17，20裂解酶作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、中山大學(xué)碩士學(xué)位論文RNA干擾對(duì)多囊卵巢綜合征雄激素合成關(guān)鍵酶17α-羥化酶/17，20裂解酶作用的實(shí)驗(yàn)研究姓名：杜靜申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：婦產(chǎn)科學(xué)指導(dǎo)教師：梁曉燕20060601中山大學(xué)碩士學(xué)位論文 中文摘要微鏡觀察及流式細(xì)胞術(shù)( f l o w c ”o m e t r y , F C M ) 檢測(cè)綠色熒光蛋白的表達(dá)反映對(duì)C Y P l 7 表達(dá)的影響，篩選出一條抑制效果最佳的s i R N A 。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，以該s i R

2、N A 為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，和n o n s p e c i f i cs i R N A 各自以1 0 n M 、2 0 n M 、5 0 n M 、1 0 0 n M 、2 0 0 n M 的濃度與質(zhì)粒、脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染，探討其抑制效果與劑量的相關(guān)性。結(jié)果1 ．將質(zhì)粒、4 條C Y P l 7 s i R N A 或n o n s p e c i f i cs i R N A 與脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染H e L a 細(xì)胞7 2 h 后，與僅轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組、n

3、 o n s p e c i f i cs i R N A 組相比較，s i R N A1 2 2 1 組綠色熒光蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)。2 ．各自以1 0 n M 、2 0 n M 、5 0 n M 、1 0 0 n M 、2 0 0 n M 的濃度與質(zhì)粒、脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染，以僅轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組的綠色熒光蛋白強(qiáng)度為1 ，各組相對(duì)綠色熒光強(qiáng)度分別為：n o ns p e c i f i cs i R N A 組：1 ．0 7 1 84 - O ．1

4、 1 4 3 5 ，0 ．9 5 6 5 士O ．1 1 4 4 3 ，O ．9 6 9 04 -0 ．1 0 1 9 3 ，0 ．8 8 4 7 4 - 0 ．3 1 3 0 3 ，1 ．2 3 5 94 - 0 ．1 8 4 3 6 ：s i R N A 1 2 2 1 組：1 ．0 7 1 64 -0 ．2 3 7 0 4 ，0 ．8 6 6 94 - 0 ．2 5 0 5 7 ，0 ．3 7 9 74 - 0 ．0 5 9 2

5、l ，0 ．5 1 4 l 4 - 0 ．】1 8 9 9 ，0 ．7 6 3 04 -O ．1 8 2 5 7 ，呈劑量相關(guān)性。結(jié)論1 ．靶向C Y P l 7 的序列特異性s i R N A 可有效地抑制外源性C Y P l 7 基因的表達(dá)。2 ．針對(duì)同一基因，采用同一濃度，設(shè)計(jì)的不同s i R N A 的抑制效果不同。3 ．同一條s i R N A ，在一定濃度范圍內(nèi)，抑制效果具有劑量相關(guān)性。第二部分C Y P l 7 s i R

6、 N A 對(duì)人卵泡膜細(xì)胞雄激素合成的影響目的應(yīng)用R N A 干擾技術(shù)探討C Y P l 7s i R N A 對(duì)體外培養(yǎng)的人卵泡膜細(xì)胞C Y P l 7基因表達(dá)的抑制效果及對(duì)雄激素合成的影響。方法將篩選出的最佳的C Y P l 7s i R N A ( s i R N A1 2 2 1 ) 與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人卵泡膜細(xì)胞，熒光定量實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)( r e a l —t i m e r e v e r s e t r a n s c r

7、 i p t i o n —p o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n ．r e a l —t i m eR T - P C R ) 檢測(cè)C Y P l 7 m R N A 的表達(dá)，競(jìng)爭(zhēng)E L I S A 法檢測(cè)培養(yǎng)液中的C Y P l 7 作用產(chǎn)物雄烯二酮( a n d r o s t e n e d i o n e ，A ) 水平，A C S l 8 0 。S E自動(dòng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)C