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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
探討免疫偶聯(lián)物胞壁酰二肽(muramyl dipeptide,MDP)-抗CD10偶聯(lián)物(MDP-Antibody,MDP-Ab)對(duì)已接種卡介苗的健康兒童外周血中記憶性T淋巴細(xì)胞活化的影響。
方法:
1、采用Ficoll-Hypaque法分離獲得健康兒童外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclearcell,PBMC),10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng),分為3
2、組:對(duì)照組(PBMC1×106/mL+抗人CD28單克隆抗體0.5μg/mL)、MDP-Ab組(抗人CD28單克隆抗體+MDP-Ab20μg/mL)、卡介苗(bacillus calmette-guerin,BCG)組(抗人CD28單克隆抗體+BCG20μg/mL),光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況及細(xì)胞形態(tài);分別于0、12、24、48、72小時(shí)收集細(xì)胞上清液,ELISA方法檢測(cè)上清液中干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ)水平。
3、
2、采集健康兒童外周血與RPMI-1640培養(yǎng)液等體積稀釋?zhuān)譃?組:對(duì)照組、MDP-Ab組、BCG組及PHA組(抗人CD28單克隆抗體+PHA20μg/mL),48小時(shí)后收集細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD3、CD4、CD45RA、CD69及胞內(nèi)IFN-γ的表達(dá)。
結(jié)果:
1、細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞形態(tài):與對(duì)照組相比,培養(yǎng)24小時(shí)后MDP-Ab組及BCG組細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞聚集,細(xì)胞團(tuán)中細(xì)胞形態(tài)可辨別。隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)
4、細(xì)胞團(tuán)的數(shù)量均增多,以BCG組最為明顯。
2、IFN-γ水平:對(duì)照組在0、12、24、48、72小時(shí)細(xì)胞上清液中IFN-γ水平分別為(401.76±17.10)pg/ml、(374.64±24.30)pg/ml、(376.53±28.96)pg/ml、(380.02±29.15) pg/ml、(390.17±33.64)pg/ml,MDP-Ab組在不同培養(yǎng)時(shí)間下細(xì)胞上清液中IFN-γ水平分別為(402.04±23.22)pg/
5、ml、(421.49±24.09)pg/ml、(456.76±41.99)pg/ml、(479.81±21.43)pg/ml、(449.10±13.66)pg/ml。兩因素重復(fù)測(cè)量資料的方差分析顯示,MDP-Ab刺激后IFN-γ的水平明顯高于對(duì)照組(F刺激=13.19,p=0.02),而培養(yǎng)時(shí)間對(duì)IFN-γ的水平無(wú)顯著影響(F時(shí)間=1.65,p=0.21);處理因素與培養(yǎng)時(shí)間之間存在交互作用(F交互=3.51,p=0.03);對(duì)不同時(shí)間
6、點(diǎn)兩組間IFN-γ的水平進(jìn)行t檢驗(yàn),MDP-Ab組IFN-γ水平在12h、24h、48h均顯著高于對(duì)照組(p均<0.05)。BCG組在不同培養(yǎng)時(shí)間下細(xì)胞上清液中IFN-γ水平分別為(405.34±30.48)pg/ml、(404.98.70±37.08) pg/ml、(444.33±22.94)pg/ml、(502.20±15.52)pg/ml、(517.84±21.54)pg/ml, 兩因素重復(fù)測(cè)量資料的方差分析顯示,BCG
7、組IFN-γ的水平明顯高于對(duì)照組(F刺激=5.49,p=0.00),且培養(yǎng)時(shí)間對(duì)IFN-γ水的水平有顯著影響(F時(shí)間=26.60,p=0.00),處理因素與培養(yǎng)時(shí)間之間存在交互作用(F交互=5.49,p=0.00);對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)兩組間IFN-γ的水平進(jìn)行t檢驗(yàn),BCG組IFN-γ水平在24h、48h、72h均顯著高于對(duì)照組(p均<0.05)。
3、記憶T淋巴細(xì)胞胞內(nèi)IFN-γ表達(dá)情況:CD3+CD4+CD45RA-IFN-γ+
8、細(xì)胞比例:對(duì)照組、MDP-Ab組、BCG組、PHA組分別為(0.010±0.017)%、(0.61±0.20)%、(1.05±0.45)%、(0.27±0.19)%。與對(duì)照組相比,MDP-Ab組的CD3+CD4+CD45RA-IFN-γ+細(xì)胞比例明顯升高(t=5.183,p=0.034),而B(niǎo)CG組及PHA組與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p均>0.05)。各組表型為CD3+CD4-CD45RA-IFN-γ+的T淋巴細(xì)胞均很少甚至不表達(dá)。
9、r> 4、記憶T淋巴細(xì)胞表面CD69表達(dá)情況:⑴ CD3+CD4+CD45RA-CD69+細(xì)胞比例:對(duì)照組、MDP-Ab組、BCG組、PHA組分別為(4.70±1.16)%、(8.99±2.75)%、(13.69±2.79)%、(8.44±3.25)%,MDP-Ab組及BCG組CD3+CD4+CD45RA-CD69+細(xì)胞比例均明顯高于對(duì)照組(p均<0.05),而PHA組與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=1.938,p=0.179);⑵ C
10、D3+CD4-CD45RA-CD69+細(xì)胞比例:對(duì)照組、MDP-Ab組、BCG組、PHA組分別為(1.41±0.31)%、(3.91±1.73)%、(6.76±3.28)%、(5.15±1.79)%,MDP-Ab組及BCG組CD3+CD4-CD45RA-CD69+細(xì)胞比例均明顯高于對(duì)照組(p均<0.05),而PHA組與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=3.601,p=0.067)。⑶ CD3+CD4+CD45RA-CD69+與CD3+CD4-
11、CD45RA-CD69+細(xì)胞比例比較:MDP-Ab、BCG兩組CD3+CD4+CD45RA-CD69+細(xì)胞比例分別為(8.99±2.75)%、(13.69±2.79)%,而CD3+CD4-CD45RA-CD69+細(xì)胞比例為(3.91±1.73)%、(6.76±3,28)%,兩組CD4+活化的記憶性T細(xì)胞比例均明顯高于CD4-活化的記憶性T細(xì)胞比例(p均<0.05)。
結(jié)論:
MDP-Ab能夠體外刺激已接種卡介苗的健康
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