自組裝納米乳液的構建及其在紫杉醇遞送中的應用研究.pdf

1、目的：
　　據統(tǒng)計，疏水性藥物在已有的藥物遞送系統(tǒng)(Drug Delivery System，DDS)中占40％-60％，而在新發(fā)現的具有療效的化合物中，疏水性化合物的比例約為70％，此外，40％的活性化合物因為其水溶性差，無法制備成合適的劑型，因而被放棄研究。提高疏水性藥物的溶解度，將具有療效的化合物制備成合適的劑型是藥劑學中急需解決的問題之一。紫杉醇在臨床上主要作為治療進展期卵巢癌的一線藥物被廣泛使用，但其疏水性極強，臨床上常

2、用的紫杉醇注射液采用聚氧乙烯蓖麻油增溶。由于聚氧乙烯蓖麻油會引起機體嚴重的超敏反應，在給予紫杉醇注射液之前要進行抗過敏處理，給藥步驟繁瑣，毒副作用強且患者依從性差;因此，通過其他遞送系統(tǒng)解決該問題具有重要的臨床應用價值。另一方面，大量研究表明納米乳給藥系統(tǒng)具有增加難溶性藥物溶解度、保護藥物免受氧化或水解、增加藥物穩(wěn)定性、增加藥物在胃腸部位的滯留時間、提高疏水性藥物的生物利用度等優(yōu)點，是增加難溶性藥物口服生物利用度的的理想劑型。但目前廣泛

3、研究的納米乳，制備時需要大量使用乳化劑和助乳化劑，存在一定的安全隱患，且必須采用高能分散方法得到小粒徑的納米乳。
　　基于上述問題，本課題提出以自組裝法構建納米乳液，將其作為疏水性藥物紫杉醇的新型遞送系統(tǒng)，期望增加紫杉醇的溶解度與生物利用度，進而提高療效。為此，首先合成了一段為聚乙烯醇(PEG)，另一段含有β-環(huán)糊精(β-CD)的親水性嵌段共聚物PEG-P[Asp(PPA)CD]，利用其中3-CD與芐醇的主-客體作用自組裝制備水包

4、油型納米乳液;結合紫杉醇在芐醇中的良好溶解性，得到載藥納米乳液。自組裝方式制備納米乳液時，不需要使用高濃度的乳化劑和助乳化劑，且制備過程簡便，給藥前不需要預處理，以此制備的載藥納米乳液能有效提高紫杉醇的口服生物利用度，提高療效的同時降低了副作用。
　　方法：
　　1.親水性共聚物PEG-P[Asp(PPA)CD]的合成
　　以三聚光氣活化天冬氨酸芐酯得到N-羧基-L-天冬氨酸-芐酯-環(huán)狀酸酐(BLA-NCA)，然后與分

5、子量5kDa的端氨基PEG共聚形成聚乙二醇-聚天冬氨酸芐酯共聚物(PEG-PBLA)，之后通過炔丙基胺的氨基反應得到PEG-P[Asp(PPA)CD]，最后通過其與單疊氮基取代的β-CD間的‘點擊’化學反應，得到親水性共聚物PEG-P[Asp(PPA)CD]。采用紅外、核磁等方法表征聚合物的結果，明確共聚物的組成。
　　2.自組裝納米乳液的構建與表征
　　以PEG-P[Asp(PPA)CD]水溶液為水相，以芐醇為油相，通過簡

6、單的渦旋方式，利用β-CD與芐醇間的主客體作用在油水界面自組裝形成納米乳;同時考察不同油相體積對納米乳形成的影響。制備載藥納米乳時，將溶有紫杉醇的芐醇溶液渦旋分散于PEG-P[Asp(PPA)CD]水溶液中即可得到。通過激光共聚焦顯微鏡對其形態(tài)進行表征，以激光粒度儀測定其粒徑、粒徑分布和多分散性指數(PDI)。
　　3.載藥納米乳液的穩(wěn)定性研究
　　將自組裝載藥納米乳液于4℃和37℃條件下保存，不同時間點通過激光粒度儀測定納

7、米乳的粒徑與PDI，高效液相色譜法(HPLC)檢測藥物含量的變化，同時觀察納米乳外觀的變化，以此評價其穩(wěn)定性。
　　4.自組裝載藥納米乳液的體外釋放
　　采用透析法對自組裝載藥納米乳液的體外釋放進行評價，以pH7.4的PBS緩沖液為釋放介質或模擬胃腸道環(huán)境下pH條件。不同時間點取樣，HPLC法檢測藥物含量。
　　5.自組裝載藥納米乳液的體外抗腫瘤活性
　　將人肺癌細胞A549與小鼠黑色素瘤細胞B16F10與不同濃

8、度的載藥納米乳液共孵育24h后，通過MTT法測定細胞存活率以初步評價自組裝載藥納米乳的體外抗腫瘤活性。
　　6.自組裝載藥裝納米乳液的體內藥代動力學研究
　　SD大鼠尾靜脈注射或口服載藥納米乳液后，不同時間點取血，通過液質聯用技術檢測大鼠血液中的紫杉醇的濃度，并運用DAS軟件分析其藥代動力學參數。
　　7.自組裝載藥納米乳液的體內抗腫瘤療效研究
　　構建裸鼠的A549移植瘤模型，待腫瘤大小約150mm3時給予藥物

9、治療，記錄其體重變化和腫瘤體積變化，14天后處死取腫瘤組織和臟器記錄其重量，并計算臟器指數，對主要的病理學切片進行蘇木精-伊紅(H&E)染色分析，同時檢測血常規(guī)水平和主要生化水平。
　　8.自組裝載藥納米乳液的急性毒性評價
　　單次尾靜脈注射大劑量載藥納米乳液于昆明小鼠，觀察14天并記錄小鼠的體重變化情況。14天后處死小鼠，取主要臟器記錄其重量，并計算臟器指數。同時，進行H&E染色病理學分析，同時檢測小鼠的血常規(guī)水平和主要生

10、化水平。
　　結果：
　　1.成功合成了親水性嵌段共聚物PEG-P[Asp(PPA)CD]，并通過核磁共振氫譜特征吸收峰與紅外吸收曲線對比證實得到了預期產物。
　　2.通過主-客體作用介導的自組裝法制備了水包油型納米乳液，激光粒度儀測得納米乳液的平均粒徑為12nm，PDI為0.26，激光共聚焦顯微鏡下觀察納米乳液外觀呈均勻球形，邊緣清晰。
　　3.為期兩個月的穩(wěn)定性試驗表明，自組裝載藥納米乳液粒徑、PDI及藥物含

11、量無明顯變化，穩(wěn)定性好。
　　4.自組裝載藥納米乳液在pH7.4條件下24h的累積釋放率為81.8％，前4個小時的累積釋放率為74.3％，在模擬胃腸道環(huán)境下24h的累積釋放率為77.9％，前4小時的累積釋放率為62.3％。
　　5.自組裝載藥納米乳液有較好的體外抗腫瘤活性，與A549細胞共孵育24h后細胞存活率為22.6％，而B16F10細胞共孵育24h后細胞存活率為10.0％。
　　6.大鼠口服或靜脈注射自組裝載藥納

12、米乳液均產生較高的血藥濃度：口服后自組裝載藥納米乳液的最高血藥濃度為4.22μg/mL，靜脈注射后自組裝載藥納米乳液的最高血藥濃度為16.22μg/mL。
　　7.口服或靜脈注射自組裝載藥納米乳液均能抑制A549移植瘤腫瘤的生長，具有較好的抗腫瘤活性。
　　8.自組裝載藥納米乳液有良好的安全性，毒副作用較低。
　　結論：
　　本課題成功地合成了親水性嵌段共聚物PEG-P[Asp(PPA)CD]，并通過主-客體介導