基于RNA-Seq技術(shù)分析氟康唑與環(huán)孢菌素A聯(lián)合應(yīng)用對生物膜態(tài)白念珠菌轉(zhuǎn)錄譜的影響.pdf

1、目的：
　　本實驗研究是以轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（RNA-Seq）為基礎(chǔ)，分析氟康唑與鈣調(diào)磷酸酶抑制劑環(huán)孢菌素A聯(lián)合應(yīng)用對生物膜態(tài)白念珠菌轉(zhuǎn)錄譜的影響，尋找并驗證與白念珠菌生物膜形成以及耐藥等相關(guān)的功能基因。
　　方法：
　　構(gòu)建白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株SC5314的生物膜模型，XTT法測定氟康唑、環(huán)孢菌素A對生物膜態(tài)白念珠菌細(xì)胞活性的影響，并將其分為生物膜態(tài)無處理組與氟康唑、環(huán)孢菌素A聯(lián)合用藥兩個處理組。提取兩處理組的RNA，利用高

2、通量RNA-Seq技術(shù)，分析聯(lián)合用藥與無處理組之間轉(zhuǎn)錄組的差異。對獲得的差異表達(dá)基因，分析其與生物膜形成、耐藥等的相互關(guān)系，并選取代謝通路進(jìn)行干預(yù)，利用實時熒光定量qRT-PCR技術(shù)對篩選出來的與標(biāo)準(zhǔn)菌株產(chǎn)生物膜能力和藥敏結(jié)果相同的白念珠菌臨床株進(jìn)行目的基因的驗證。
　　結(jié)果：
　　通過產(chǎn)膜能力實驗，篩選出8株與標(biāo)準(zhǔn)菌株產(chǎn)膜能力相同的臨床菌株，且臨床菌株對氟康唑的藥敏結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)菌株一致，均為敏感。觀察生物膜形成過程發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)

3、至48h時，生物膜已成熟。棋盤法藥敏實驗結(jié)果顯示，當(dāng)單用環(huán)孢菌素A及單用氟康唑時，與無處理相比，抑制生物膜的效果極低。然而當(dāng)用濃度為75μg/ml的環(huán)孢菌素A與32μg/ml的氟康唑聯(lián)合使用時，顯示出較強的抗生物膜作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。針對測序結(jié)果，共發(fā)掘231個新基因及522個差異表達(dá)基因，包括253個上調(diào)基因和269個下調(diào)基因。通過分析，初步篩選出9個目的基因，GO功能分類結(jié)果顯示，這些基因主要涉及細(xì)胞壁、漿膜的合成，外排轉(zhuǎn)運，免

4、疫反應(yīng)，菌相轉(zhuǎn)換等功能。KEGG分析表明這些差異表達(dá)基因參與糖酵解，脂肪酸代謝，細(xì)胞因子受體相互作用，細(xì)胞分裂等信號通路。利用臨床白念珠菌對目的基因驗證發(fā)現(xiàn)，這些目的基因變化與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致。其中，als3，cdr1，cln1，cln2，rfg1，erg3，ddc1表達(dá)量呈不同程度的升高或降低，與無處理相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（而cpp1，efg1呈現(xiàn)出升高和降低的趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義）。針對差異基因所注釋到的通路糖代謝途徑進(jìn)行干預(yù)，

5、發(fā)現(xiàn)乙醛酸循環(huán)途徑與白念珠菌感染息息相關(guān)。針對乙醛酸循環(huán)途徑進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果表明當(dāng)抑制乙醛脫氫酶時，生物膜形成相關(guān)基因表達(dá)量升高；當(dāng)乙醇含量增加時，與生物膜形成相關(guān)的基因表達(dá)量反而減低。因此在后續(xù)的實驗中，我們可以以此作為新的切入點，深入探索白念珠菌生物膜與耐藥性的相關(guān)機制。
　　結(jié)論：
　　1.通過觀察白念珠菌生物膜的形成過程發(fā)現(xiàn)，起初以酵母態(tài)白念珠菌為主，但隨著時間不斷延長，酵母態(tài)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榫z態(tài)。至48h時菌絲交織非常密

6、集，細(xì)胞外基質(zhì)分泌較多，之后生物膜增長較少，此時生物膜已成熟。
　　2.通過藥敏實驗發(fā)現(xiàn)，生物膜態(tài)白念珠菌對氟康唑的敏感性顯著降低。當(dāng)在聯(lián)合環(huán)孢菌素A后，其可以降低生物膜對氟康唑的耐藥性，增強抗菌效果。
　　3.通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，共發(fā)現(xiàn)了231個新基因以及522個差異表達(dá)基因。通過對差異表達(dá)基因進(jìn)行初步分析、功能注釋及利用臨床株驗證，初步尋找出9個相關(guān)的目的基因。在驗證目的基因的過程中，一方面證實了它們的功能，同時也用功能