核酸分子雜交技術(shù)與應(yīng)用綜述

1、核酸分子雜交技術(shù)與應(yīng)用綜述 核酸分子雜交技術(shù)與應(yīng)用綜述摘要 核酸分子雜交技術(shù)是 20 世紀 70 年代發(fā)展起來的一種嶄新的分子生物學(xué)技術(shù)。它是基于 DNA 分子堿基互補配對原理，用特異性的核酸探針與待測樣品的 DNA/RNA 形成雜交分子的 過程。分子雜交實驗依據(jù)其形式的不同可以分為液相雜交、固相雜交、原位雜交，而固相雜交又可以分為菌落雜交、點/狹縫雜交、Southern 印跡雜交和 Northern 印跡雜交。各類型雜交稻基本原理和步

2、驟是基本相同的，只是選用的雜交原材料、點樣方法有所不同。關(guān)鍵字 關(guān)鍵字 核酸分子雜交 液相雜交 固相雜交 原位雜交 應(yīng)用本文是對分子雜交技術(shù)的原理和類型分類及其應(yīng)用的一篇綜述。旨在了解各種雜交類型的應(yīng)用方向，即在生物、醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用。一、 一、 核酸分子雜交原理 核酸分子雜交原理DNA 分子是由兩條單鏈形成的雙股螺旋結(jié)構(gòu)，維系這一結(jié)構(gòu)的力是兩條單鏈堿基氫鍵和同一單鏈上相鄰堿基間的范德華力。在一定條件下，雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解

3、開，形成無規(guī)則線團，DNA 分子成為單鏈，這一過程稱作變性或融解。加熱、改變 DNA 融解的 pH值，或有機溶劑等理化因素，均可使 DNA 變性。變性的 DNA 粘度下降，沉降速度增加，浮力 上升，紫外光吸收增加。在溫度升高引起的 DNA 變性過程中，DNA 的變性會在一個很狹窄的溫度范圍內(nèi)發(fā)生，這一溫度范圍的重點被稱作融解溫度 Tm。Tm 值得大小取決于核酸分子的G-C 含量，核酸分子的 G-C 含量越高，其 Tm 值越高。因為 G-

4、C 堿基之間有三個氫鍵，而 A-T堿基之間只有兩個氫鍵。變性 DNA 只要消除變性條件，具有堿基互補的單鏈又可以重新結(jié)合形成雙鏈，這一過程稱作復(fù)性。根據(jù)這一原理，將一種核酸單鏈標記成為探針，再與另一種 核酸單鏈進行堿基互補配對，可以形成異源核酸分子的雙鏈結(jié)構(gòu)，這一過程稱作雜交（hybridization） 。雜交分子的形成并不要求兩條單鏈的堿基順序完全互補，所以不同來源 的核酸單鏈只要彼此之間有一定程度的互補序列就可以形成雜交體。二、

5、二、 核酸分子雜交類型 核酸分子雜交類型（一） 固相雜交固相雜交是把欲檢測的核酸樣品先結(jié)合到某種固相支持物上，再與溶解于溶液中的雜家 探針進行反應(yīng)，雜交結(jié)果可用儀器進行檢測，但大多數(shù)情況下直接進行放射自顯影，然后根據(jù)自顯影圖譜分析雜交結(jié)果。 1、 菌落雜交用于重組細菌克隆篩選的固相雜交，稱作菌落雜交。主要步驟包括菌落平板培養(yǎng)、濾膜 滅菌后放到細菌平板上，使菌落粘附到濾膜上，將濾膜放到經(jīng)適當溶液飽和度吸水紙上，菌斑溶解產(chǎn)生單鏈的 DNA，

6、固定 DNA 用 32P 標記的單鏈探針與菌落 DNA 進行雜交。雜交后，洗 脫未結(jié)合的探針，將濾膜暴露于 X 線膠片進行放射自顯影。將自顯影膠片、濾膜、培養(yǎng)平板比較就可以確定陽性菌落。Northern 印記技術(shù)多用來檢查基因組中某個特定的基因是否得到轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄的相對水 平。目前，Northern 印記技術(shù)仍然被認為是檢測基因表達水平的金標準。（3） 液相雜交以液相雜交技術(shù)為基本工作原理設(shè)計的多功能懸浮點陣儀是液態(tài)芯片技術(shù)應(yīng)用的典范。

7、這一技術(shù)平臺已被應(yīng)用于遺傳突變的分子診斷，如出生缺陷干預(yù)工程中的 Down’s 綜合征、珠蛋白合成障礙性貧血、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷的基因診斷，也已被用于 SNPs 分析、感 染性疾病的鑒別診斷、藥物敏感性和親子鑒定。此外，還可以應(yīng)用于基因表達譜的分析，從而進行腫瘤性疾病如血液病、乳腺癌、肝癌、胃癌、肺癌、膀胱癌和結(jié)腸癌的分子病理學(xué)研究。 （4） 熒光原位雜交(FISH)技術(shù)1、 細胞遺傳學(xué)分析①產(chǎn)前診斷：在新生兒的先天性疾病中，染

8、色體的數(shù)目異常要占很大的一部分，其中以染色體 X、Y、13、18 和 21 數(shù)量的異常最為多見。利用 FISH 技術(shù)的優(yōu)勢還可以用于產(chǎn)前診斷中的羊水細胞核型分析。常規(guī)的染色體型分析技術(shù)需要對羊水細胞進行培養(yǎng)，時間較長。FISH 技術(shù)可以在少量的羊水 細胞涂片上進行異常染色體的數(shù)目分析，不需要羊水細胞的培養(yǎng)，記得地縮短了病人等待的時間。 ②生殖醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用：采用 FISH 技術(shù)可對一個卵裂球的染色體進行檢測，排除存在染色體異常的胚胎，提高

9、胚胎種植成功率。另一方面，對精子染色體的研究已經(jīng)成為男性不育者精子檢測的一項重要內(nèi)容。③血液疾病中染色體易位的檢測：在化療后緩解的慢性粒細胞性白血病病人的標本中，采用 FISH 技術(shù)極易發(fā)現(xiàn)殘存的白血病細胞，確定微小殘留病灶。FISH 檢測的結(jié)果對白血病的診斷、治療和預(yù)后的估計提供了有力的依據(jù)，也為白血病 機制的研究提供了線索。2、 病原學(xué)檢測：采用 FISH 技術(shù)還可以快速鑒定血培養(yǎng)中的微生物、送檢樣本中的病毒等，采用診斷微生物 DN

10、A 或 RNA 的熒光標記探針可以直接快速地檢測出微生物病原體核酸， 檢測靈敏度較高。3、比較基因組雜交 4、基因圖譜繪制5、診斷微生物菌落結(jié)構(gòu)與群落動態(tài) 6、監(jiān)測微生物的原位生理學(xué)7、FISH 技術(shù)結(jié)合流式細胞術(shù)定量化檢測微生物四、 四、 展望 展望盡管核酸分子雜交技術(shù)的應(yīng)用越來越廣泛，但其在臨床實用中仍存在不少問題，必須提 高檢測單拷貝基因的敏感性，用非放射性物質(zhì)代替放射性同位素標記探針以及簡化實驗操作和縮短雜交時間，這樣，就需要在