分子雜交技術(shù)

1、第五節(jié) 核酸的分子雜交Nucleic Acid Hybridization,Content of Table,前 言1 核酸分子雜交技術(shù)的原理2 核酸探針的制備3 核酸探針的標(biāo)記4 核酸分子雜交技術(shù)5 生物芯片技術(shù),前 言,核酸分子雜交 把親源關(guān)系較近的，不同生物個(gè)體來源的變性DNA或RNA單鏈，經(jīng)退火處理形成DNA-DNA或DNA-RNA這一過程叫分子雜交。,Home,1 核酸分子雜交技術(shù)的原理,有互補(bǔ)

2、特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA混在一起時(shí)，其相應(yīng)同源區(qū)段將會退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)。 如把一段已知基因（DNA或RNA）核酸序列用合適標(biāo)記物（如放射性同位素、生物素等）予以標(biāo)記，當(dāng)作探針（probe), 與變性后的單鏈基因組DNA或RNA進(jìn)行雜交。 再用合適方法（如放射自顯影或免疫組織化學(xué)等技術(shù)）把標(biāo)記物檢測出來，就可確定靶核苷酸序列是否存在、拷貝數(shù)及表達(dá)豐度等。,應(yīng) 用：(1)檢測特定生物有機(jī)體之間是否存在親緣關(guān)系

3、；(2)用來揭示核酸片段中某一特定基因的存在與否、拷貝數(shù)及表達(dá)豐度。,Home,2 核酸探針的制備,2.1 探針（Probe)的概念: 一段帶有檢測標(biāo)記的與目的基因或目的DNA特異互補(bǔ)的已知核苷酸序列。,2.2 探針的制備方法,長度一般以50~300bp為宜。制備方法： (1) DNA重組技術(shù) (2) PCR擴(kuò)增 (3) 化學(xué)合成,2.3 探針的分類 據(jù)來源及性質(zhì)不同可分為： (1) 基因

4、組DNA探針 (2) cDNA探針 (3) RNA探針 (4) 寡核苷酸探針,2.4 合成寡核苷酸探針注意原則,(1) 長度（10-50 bp); (2) G:C對含量40%-60%；(3) 探針內(nèi)避免互補(bǔ)；(4) 避免同一堿基連續(xù)出現(xiàn)；(5) 與非靶序列有70%以上同源性或連續(xù)8個(gè)以上堿基序列相同，最好不用。,Home,3 核酸探針的標(biāo)記,為確定探針是否與相應(yīng)基因組DNA雜交，有必要對探針加以標(biāo)記，以便在結(jié)合部位獲得可

5、識別的信號。,3.1 標(biāo)記的種類,同位素： 32P、35S、3H、125I等標(biāo)記探針非同位素： 生物素、地高辛配體、熒光素等作為標(biāo)記物 兩者比較：后者不及前者敏感，但后者保存時(shí)間較長，無同位素污染。,一個(gè)理想的標(biāo)記物應(yīng)滿足：(1)標(biāo)記前后探針基本結(jié)構(gòu)、化學(xué)性質(zhì)相同;(2)特異性強(qiáng)、本底低、重復(fù)性好；(3)操作簡單、節(jié)時(shí)；(4)安全、無環(huán)境污染。,3.2 探針的標(biāo)記方法,3.2.1 缺口平移法3.2.2

6、隨機(jī)引物標(biāo)記法3.2.3 末端標(biāo)記法3.2.4 生物素光照標(biāo)記法,Home,缺口平移法的原理,將DNAase I 的水解活性與大腸桿菌DNA polymerase I 的5`→3`的聚合酶活性和5` →3`的外切酶活性相結(jié)合。 首先用E.coli的DNAse I 在探針DNA雙鏈上造成缺口，然后再借助于DNA pol I的5`→3`外切酶活性，切去帶有5`-磷酸的核苷酸；同時(shí)利用該酶5`→3`聚合酶活性，使生物素或同位素標(biāo)記的互

7、補(bǔ)核苷酸補(bǔ)入缺口。 這兩種活性同時(shí)作用，缺口不斷向3`方向移動，DNA鏈上的核苷酸不斷為標(biāo)記的核苷酸取代，成為帶有標(biāo)記的DNA，純化除去游離脫氧核苷酸后成為標(biāo)記DNA探針。,,Klenow酶的基本用途：,補(bǔ)平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5‘粘性末端DNA片段的同位素末端標(biāo)記cDNA第二鏈的合成雙脫氧末端終止法測定DNA序列,隨機(jī)引物標(biāo)記法原理,用一些六核苷酸作為隨機(jī)引物，將這些引物和探針DNA片段一起熱變性，退火后，引物與單鏈DNA互補(bǔ)

8、結(jié)合，再在DNA聚合酶的作用下，按堿基互補(bǔ)配對原則不斷在其3`- OH端添加標(biāo)記的單核苷酸修補(bǔ)缺口，合成新的標(biāo)記的探針片段。,,末端標(biāo)記法原理,（1）一種是在5`末端加成標(biāo)記法： 先用堿性磷酸酶（AP）去掉dsDNA 5`-磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化標(biāo)記的ATP 的γ-磷酸轉(zhuǎn)移加到DNA片段5`-OH上。（2）在探針3`-末端用末端轉(zhuǎn)移酶摻入一個(gè)單標(biāo)記的[α-32P]dNTP。,,核酸修飾酶3、T4-多核苷酸磷酸激酶（

9、T4-PNP）,T4--PNP的基本特性：在DNA、RNA、ddNR、NR的5‘‘--OH上加磷,用于探針的末端同位素標(biāo)記,3‘ HO,5‘ HO,3‘ HO,5‘ HO,p 5‘,p 5‘,3‘ HO,3‘ HO,,,,,,T4--PNP,pppATP,生物素光照標(biāo)記法,光敏生物素在紫外線照射下與DNA或RNA的堿基發(fā)生化學(xué)加成反應(yīng)，獲得生物素標(biāo)記的DNA探針。,,4 核酸分子雜交技術(shù),此技術(shù)由Southern 1975年首先設(shè)計(jì)

10、。被檢測對象為DNA。,4.1 Southern 印跡雜交,帶有DNA片段的凝膠,,Southern 印跡雜交的技術(shù)流程,,,,,白瓷盤,玻璃板,濾紙,凝膠,,尼龍膜,濾紙,吸水紙,玻璃板,重物,吸水紙轉(zhuǎn)膜,。,真空轉(zhuǎn)膜,4.2 Northern印跡雜交,與Southern雜交類似。檢測目的RNA的存在與否及含量。,4.3 Western印跡雜交,將待檢測蛋白質(zhì)（或酶）經(jīng)PAGE電泳并染色后，轉(zhuǎn)移到濾膜上固定，再用“抗體-抗原”免

11、疫反應(yīng)或“DNA-protein”結(jié)合反應(yīng)鑒別濾膜上的蛋白質(zhì)。,4.4 斑點(diǎn)印跡雜交和狹線印跡雜交,Dot blotting and slot blotting,適于核酸樣品定量檢測，而不是定性檢測。,4.5 原位雜交in situ hybridization,分為菌落、噬菌斑及真核細(xì)胞原位雜交,Home,5 生物芯片,生物芯片（biochip）是近年來在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展起來的一項(xiàng)高新技術(shù)，主要是指通過微加工技術(shù)和微電

12、子技術(shù)在固體芯片表面構(gòu)建的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞、蛋白質(zhì)、DNA及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速與大信息量的檢測。,5.1 生物芯片的分類,(1) DNA芯片(Gene chip, DNA chip, DNA microarray)(2) 蛋白質(zhì)芯片(Protein chip)(3) 芯片實(shí)驗(yàn)室(Lab-on-a-chip),基因芯片：是指將大量探針分子固定在物體表面，與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測每個(gè)探針分子的雜交信號強(qiáng)

13、度，進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和系列信息。它以其可同時(shí)、快速、準(zhǔn)確地分析數(shù)以千計(jì)的基因組信息而顯示巨大威力。目前，基因芯片已經(jīng)應(yīng)用于基因表達(dá)檢測、尋找新基因、雜交測序、基因突變等許多方面。,基因芯片,蛋白芯片：是以蛋白質(zhì)代替DNA作為檢測對象，比基因芯片更進(jìn)一步接近生命活動的物質(zhì)層面，因而有著比基因芯片更加直接的應(yīng)用前景。,蛋白芯片,芯片實(shí)驗(yàn)室：是生物芯片技術(shù)發(fā)展的最終目標(biāo)。它將樣品制備、生化反應(yīng)和檢測分析的全過程集約化，形成微型分析系

14、統(tǒng)。目前，這種形式尚處于研發(fā)階段。,芯片實(shí)驗(yàn)室,5.2 DNA芯片技術(shù)的基本原理,DNA芯片技術(shù)的基本原理是分子識別，與Southern雜交和Northern雜交同出一理，即DNA的堿基互補(bǔ)配對和序列互補(bǔ)原理。,據(jù)芯片的性能與用途分： 1）毛細(xì)管型微芯片 2）基因探針型微芯片據(jù)DNA芯片上微排列的DNA不同分： 1）寡核苷酸芯片 2）cDNA芯片,5.3 DNA芯片的類別,◆芯片方陣的構(gòu)建◆樣品制備◆生