原位雜交技術(shù)原理及其應(yīng)用

1、原位雜交技術(shù) in situ hybridization,,核酸分子雜交技術(shù),在研究DNA分子復(fù)制原理的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種技術(shù)。兩條核苷酸單鏈片段，通過氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA雙鏈分子按其作用方式可大致分為兩種：固相雜交和液相雜交液相雜交是指參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中。液相分子雜交技術(shù)包括吸附雜交、發(fā)光液相雜交、液相夾心雜交和復(fù)性速率液相分子雜交等,固相雜交是將參加反應(yīng)的一條核酸鏈固定

2、在固體的支持物上（常用的有硝酸纖維素濾膜，其它如尼龍膜、乳膠顆粒和微孔板等），另一條參加反應(yīng)的核酸鏈游離在溶液中。固相雜交包括：菌落原位雜交（colony in situ hybridization）、斑點(diǎn)雜交（Dot blot）、Southern印跡雜交（Southern blot）Northern印跡雜交（Northern blot）組織原位雜交（Tissue in situ hybridization），即原位雜交組織化

3、學(xué)技術(shù)和原位雜交免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù),原位雜交技術(shù)的基本原理,利用核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基順序，通過堿基對(duì)之間非共價(jià)鍵的形成，出現(xiàn)穩(wěn)定的雙鏈區(qū)，形成雜交的雙鏈。1.兩條核苷酸單鏈片段，在適宜的條件下，通過氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或 RNA-RNA 雙鍵分子2.應(yīng)用帶有標(biāo)記的（有放射性同位素，如3H、35S、32P，熒光素、生物素、地高辛等非放射性物質(zhì))DNA或 RNA片段作為核酸探針,與組織切片或細(xì)胞內(nèi)待測(cè)核酸(

4、RNA或DNA）片段進(jìn)行雜交3.用放射自顯影等方法予以顯示，在光鏡或電鏡下觀察目的 mRNA或DNA 的存在與定位,用原位雜交術(shù)，可在原位研究細(xì)胞合成某種多肽或蛋白質(zhì)的基因表達(dá)。 此方法有很高的敏感性和特異性，可進(jìn)一步從分子水來探討細(xì)胞的功能表達(dá)及其調(diào)節(jié)機(jī)制。已成為當(dāng)今細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)研究的重要手段。,Aromase gene The rat brain section,In situ hybridization,培養(yǎng)細(xì)胞

5、,原位雜交組織化學(xué)技術(shù)發(fā)展,1961年，Hall 液相核酸雜交技術(shù)1969年，Gall 和Pardue 用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細(xì)胞雜交，確定該基因定位于卵母細(xì)胞的核仁中。1969年，Buongiorno-Nardelli和Amaldi John 利用同位素標(biāo)記核酸探針進(jìn)行了細(xì)胞或組織的基因定位，創(chuàng)造了原位雜交細(xì)胞或組織化學(xué)技術(shù)。Orth（1970）應(yīng)用3H標(biāo)記的兔乳頭狀瘤病毒cRNA探針與兔乳頭狀瘤組織的冰凍切片進(jìn)行雜交，首

6、次用原位雜交檢測(cè)了病毒DNA在細(xì)胞中的定位，但當(dāng)時(shí)的工作多采用冰凍組織切片或培養(yǎng)細(xì)胞，探針均采用同位素標(biāo)記。,由于同位素標(biāo)記探針具有放射性既污染環(huán)境，又對(duì)人體有害，且受半衰期限制等缺點(diǎn)，科學(xué)工作者們開始探索用非放射性的標(biāo)記物標(biāo)記核酸探針進(jìn)行原位雜交。Bauman（1981）等首先應(yīng)用熒光素標(biāo)記cRNA探針做原位雜交，然后用熒光顯微鏡觀察獲得成功。Shroyer（1982）報(bào)道用2，4二硝基苯甲醛（DNP）標(biāo)記DNA探針，使該DNA探

7、針具有抗原性，然后用兔抗DNP的抗體來識(shí)別雜交后的探針，最后經(jīng)免疫過氧化物酶的方法來定位雜交探針。這兩種方法至今仍有采用，但因敏感度不夠高，應(yīng)用不夠普遍。,Pezzella（1987）創(chuàng)建了用磺基化DNA探針來做細(xì)胞或組織原位雜交的方法，其基本原理是使DNA探針的胞嘧啶堿基磺基化，利用單克隆抗體識(shí)別磺基化探針，再通過免疫組化方法顯示結(jié)合的單克隆抗體，從而對(duì)雜交結(jié)合的探針進(jìn)行定位。本法的優(yōu)點(diǎn)是磺基化DAN探針標(biāo)記簡便，不需作缺口平移標(biāo)

8、記，敏感度也較高。生物素標(biāo)記探針技術(shù)是Brigat（1983）首先建立的，它利用生物素標(biāo)記的探針在組織切片上檢測(cè)了病毒DNA，通過生物素與抗生物素結(jié)合，過氧化物酶-抗過氧化物酶顯示系統(tǒng)顯示病毒DNA在細(xì)胞中的定位。生物素標(biāo)記探針技術(shù)目前已被廣泛應(yīng)用，特別是在病毒學(xué)和病理學(xué)的臨床診斷中。,上述生物素標(biāo)記技術(shù)又叫酶促生物素標(biāo)記技術(shù)。另一種叫光促生物素標(biāo)記核酸技術(shù)（1985） ，該技術(shù)是用光敏生物素（Photobiotin）標(biāo)記核酸。目前

9、應(yīng)用的光敏生物素有乙酸鹽和補(bǔ)骨脂素生物素，它們都是由三個(gè)部分組成：光敏基團(tuán)、連結(jié)臂和生物素。在強(qiáng)光下，不需酶反應(yīng)，光敏生物素的光敏基團(tuán)即可與核酸中的堿基相結(jié)合。光敏生物素標(biāo)記核酸，方法簡單，靈敏度也不低，但標(biāo)記效率不高，每100～150個(gè)堿基才能標(biāo)記一個(gè)生物素，對(duì)于短的基因探針特別是寡核苷酸探針不宜使用，以免因標(biāo)記數(shù)過少而影響靈敏度。,近年來，地高辛（Digoxigonin）標(biāo)記技術(shù)引起科技工作者的極大興趣。Boeringer Man

10、nhem Bio－chemisca于1987年將地高辛標(biāo)記的有關(guān)試劑及藥盒投放市場。和其它非放射性標(biāo)記物一樣，地高辛較放射性標(biāo)記系統(tǒng)安全，方便、省時(shí)間。同時(shí)在敏感性和質(zhì)量控制方面比生物素標(biāo)記技術(shù)要優(yōu)越，可以檢測(cè)出人基因組DNA中的單拷貝基因。地高辛標(biāo)記法顯示的顏色為紫藍(lán)色（標(biāo)記堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶顯色系統(tǒng)），有較好的反差背景。,核酸探針的分類,核酸探針根據(jù)標(biāo)記方法的不同可粗略分為放射性探針和非放射性探針兩類。根據(jù)探針的核酸性質(zhì)不

11、同可分為DNA探針、RNA探針、cDNA探針、cRNA探針和寡核苷酸探針等。DNA探針還有單鏈DNA（Single stranded, ssDNA）和雙鏈DNA（Double stranded, dsDNA）之分。,早期應(yīng)用的主要是DNA探針Temin在70年代研究致癌RNA病毒時(shí)制備了cDNA探針（complementary DNA），其基本原理是以RNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）又稱為RNA

12、指導(dǎo)的DNA聚合酶催化產(chǎn)生的。該酶以RNA為模板，按照RNA的核苷酸順序合成DNA，這一途徑與一般遺傳信息流的方向相反，故稱逆轉(zhuǎn)錄。cDNA是指互補(bǔ)于mRNA的DNA分子。,RNA探針是將特異性的cDNA片段插入含有RNA聚合酶啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄性載體。這類載體包括pSP64和pSP65，它們具有不同的啟動(dòng)子在多克隆位點(diǎn)的各側(cè)。Psp64和pSP65在sP6啟動(dòng)子的多克隆位點(diǎn)的方向是不同的。通過改變外源基因的插入方向或選用不同的RNA聚合酶

13、，可以控制RNA的轉(zhuǎn)錄方向，即以哪條DNA鏈為模反轉(zhuǎn)錄RNA。從而可以得到與mRNA同序列的同義RNA探針（Sense probe）和與mRNA互補(bǔ)的反義RNA探針（antisense probe），又稱互補(bǔ)RNA探針（complementary RNA probe , cRNA）。通常用同義RNA探針做為反義RNA探針的陰性對(duì)照。由于RNA探針是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應(yīng)極高。有報(bào)告認(rèn)為其雜交率高于DNA探針的8倍。,DN

14、A合成儀的誕生使制造寡核苷酸探針成為可能，與上述探針不同的是寡核苷酸探針不是克隆性DNA探針，它是由DNA合成儀依照所需雜交的靶核苷酸序列合成的。具有制造方便，價(jià)格低廉的優(yōu)點(diǎn)，也可進(jìn)行放射性與非放射性標(biāo)記，但其特異性不如克隆性探針強(qiáng)，亦不如其雜交信號(hào)高。,原位雜交組織化學(xué)技術(shù)的基本步驟,大致可分為：①雜交前準(zhǔn)備，包括固定、取材、玻片和組織的處理，如何增強(qiáng)核酸探針的穿透性、減低背景染色等；②雜交；③雜交后處理；④顯示（visua

15、lization）：包括放射性自顯影和非放射性標(biāo)記的顯色。,（一）固定 兼顧三個(gè)方面：保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)，最大限度地保持細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA的水平；使探針易于進(jìn)入細(xì)胞或組織。DNA是比較穩(wěn)定的，mRNA卻絕然不同，非常容易被降解。因此，對(duì)于DNA的定位來說，固定劑的種類和濃度并不十分重要。相反，在RNA的定位上，如果要使RNA的降解減少到最低限度，那么，不僅固定劑的種類濃度和固定的時(shí)間十分重要，而且取材后應(yīng)盡快予以冷凍或固定。在解

16、釋ISHH的結(jié)果時(shí)應(yīng)考慮到取材至進(jìn)入固定劑或冰凍這段時(shí)間對(duì)RNA保存所帶來的影響，因組織中mRNA的降解是很快的。,在固定劑中，最常用的是多聚甲醛。對(duì)于mRNA的定位，我們常采用的方法是將組織固定于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中1～2h，在冷凍前浸入15%蔗糖溶液中，置4℃冰箱過夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片機(jī)或振蕩切片機(jī)切片。組織也可在取材后直接置入液氮冷凍，切片后才將其浸入4%多聚甲醛約10min，空氣干燥后保存在-70℃。如

17、冰箱溫度恒定，在-70℃可保存數(shù)月之久不會(huì)影響雜交結(jié)果。在病理學(xué)活檢取材多用福爾馬林固定和石蠟包埋，這種標(biāo)本對(duì)檢測(cè)DNA和mRNA有時(shí)也可獲得雜交信號(hào)，但石蠟包埋切片由于與蛋白質(zhì)交叉連接的增加，影響核酸探針的穿透，因而雜交信號(hào)常低于冰凍切片。同時(shí)，在包埋的過程中可減低mRNA的含量。,（二）玻片和組織切片的處理　　1．玻片的處理玻片包括蓋片和載片 應(yīng)用熱肥皂刷洗，自來水清洗干凈后，置于清潔液中浸泡24h，清水洗凈烘干，95%

18、酒精中浸泡24h后蒸餾水沖洗、烘干，烘箱溫度最好在150℃或以上過夜以去除任何RNA酶。蓋玻片在有條件時(shí)最好用硅化處理，錫箔紙包裹無塵存放?！　∮捎贗SHH的實(shí)驗(yàn)周期長，實(shí)驗(yàn)程序繁雜，因此，要應(yīng)用粘附劑預(yù)先涂抹在玻片上，干燥后待切片時(shí)應(yīng)用，以保證在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中切片不致脫落。,常用的粘附劑有鉻礬-明膠液，其優(yōu)點(diǎn)是價(jià)廉易得，但在長周期實(shí)驗(yàn)過程中，粘附效果不夠理想。多聚賴氨酸液具有較好的粘附效果，但價(jià)格昂貴，需進(jìn)口。近年Vector

19、Lab (U.S.A.)推出一種新的粘附劑叫Vectorband Reagent,每一單位包裝可制備500～700張載玻片，粘附效果極佳，價(jià)格較多聚賴氨酸便宜，制片后可長期保存應(yīng)用。,2．增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性 此步驟根據(jù)應(yīng)用固定劑的種類、組織的種類、切片的厚度和核酸探針的長度而定。 增強(qiáng)組織通透性常用的方法如應(yīng)用稀釋的酸洗滌、去垢劑（detergent）或稱清洗劑Triton X-100、酒精或某些消化酶如

20、胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白酶和淀粉酶（diastase）等。 這種廣泛的去蛋白作用無疑可增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性，提高雜交信號(hào)，但同時(shí)也會(huì)減低RNA的保存和影響組織結(jié)構(gòu)的形態(tài)，因此，在用量及孵育時(shí)間上應(yīng)慎為掌握。,蛋白酶K（Proteinase K）:1μg/ml(于0.1mol/l Tris/50mmol/L EDTA, pH8.0緩沖液中),37℃孵育15～20min，以達(dá)到充分的蛋白消化作用而不致影響組織的形態(tài)

21、為目的。蛋白酶K還具有消化包圍著靶DNA的蛋白質(zhì)的作用，從而提高雜交信號(hào)。在蛋白酶K消化后，應(yīng)用0.1mol/L的甘氨酸溶液（在PBS中）清洗以終止蛋白酶K的消化作用，甘氨酸是蛋白酶K的抑制劑。為保持組織結(jié)構(gòu)，通常用4%多聚甲醛再固定。Burns等（1987）報(bào)告應(yīng)用胃蛋白酶（Pepsin）20～100μg/ml（用0.1n HCl 配）37℃、30min進(jìn)行消化，所獲實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)于蛋白酶K。,多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐（aceti

22、c anhydride）和三乙醇胺（tri－ethanolamine）中以減低靜電效應(yīng)，減少探針對(duì)組織的非特異性背景染色。有的作者除在室溫下浸于上述溶液10min外，還在預(yù)熱37℃的50%甲酰胺/2×SSC液中預(yù)雜交15min，然后用2×SSC，0.30mol/l NaAc/0.030mol/L枸櫞酸鈉液中浸15min。但也有報(bào)道乙酸酐和三乙醇胺液的處理并不能起到減低背景的目的，不能改善ISHH的信/噪比例。,3

23、．減低背景染色 雜交后（Posthybridization）的酶處理和雜交后的洗滌均有助于減低背景染色。　　預(yù)雜交（Prehybridization）是減低背景染色的一種有效手段。預(yù)雜交液和雜交液的區(qū)別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖（Dextran sulphate）。將組織切片浸入預(yù)雜交液中可達(dá)到封閉非特異性雜交點(diǎn)的目的，從而減低背景染色。,4．防止RNA酶的污染 由于在手指皮膚及實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿上均可能含有RNA

24、酶，為防止其污染影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在整個(gè)雜交前處理過程都需戴消毒手套。所有實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿及鑷子都應(yīng)于實(shí)驗(yàn)前一日置高溫（240℃）烘烤以達(dá)到消除RNA酶的目的。 要破壞RNA酶，其最低溫度必須在150℃左右。雜交前及雜交時(shí)所應(yīng)用的溶液均需經(jīng)高壓消毒處理。,（三）雜交（Hybridisation）　　雜交是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片。加蓋片的目的是防止孵育過程中的高溫（50℃左右）導(dǎo)致雜交液的蒸發(fā)。硅化的蓋玻片的優(yōu)點(diǎn)

25、是清潔無雜質(zhì)，光滑不會(huì)產(chǎn)生氣泡和影響組織切片與雜交液的接觸，蓋玻片自身有一定重量能與有限的雜交液吸附達(dá)到覆蓋和防止蒸發(fā)的作用。為保證雜交所需的濕潤環(huán)境，放在濕盒中進(jìn)行孵育。,注意事項(xiàng)1．探針的濃度很難事先確定，但要掌握一個(gè)原則，即探針濃度必須給予該實(shí)驗(yàn)最大的信/噪比值。　　非放射性標(biāo)記（生物素或地高辛）探針濃度為0.5～5.0μg/ml（即0.5～5.0ng/μl）。放射性標(biāo)記的dsDNA或cRNA探針濃度在2～5ng/μl?！　?/p>

26、必須強(qiáng)調(diào)的是，加雜交液的量要適當(dāng)，以10～20μl/每張切片為宜。雜交液過多不僅造成浪費(fèi)，而且液量過多常易致蓋玻片滑動(dòng)脫落，影響雜交效果，過量的雜交液含核酸探針濃度過高，反易導(dǎo)致高背景染色等不良后果。,2．探針的長度 一般應(yīng)用于ISHH探針的最佳長度應(yīng)在50～100個(gè)堿基之間。探針短易進(jìn)入細(xì)胞，雜交率高，雜交時(shí)間短。,3．雜交的溫度和時(shí)間原位雜交中，多數(shù)DNA探針需要的Tm是90℃，而RNA則需要95℃。在雜交的程序中常

27、規(guī)的加入30%～50%甲酰胺（for－mamide）于雜交液中。反應(yīng)液中每增加1%的甲酰胺濃度，Tm值可降低0.72℃?？捎谜{(diào)節(jié)鹽濃度的辦法來調(diào)節(jié)Tm。由于鹽和甲酰胺濃度的調(diào)節(jié)等因素，實(shí)際采用的原位雜交的溫度在Tm-25℃左右，即比Tm減低25℃，大約在30～60℃之間根據(jù)探針的種類不同，溫度略有差異，RNA和cRNA探針一般在37～42℃左右，而DNA探針或細(xì)胞內(nèi)靶核苷酸為DNA的，則必須在80～95℃加熱使其變性，時(shí)間5～15

28、min，然后在冰上擱置1min，使之迅速冷卻，以防復(fù)性，再置入盛有2×SSC的溫盒內(nèi)，在37～42℃孵育雜交過夜。,從理論上講，核苷酸雜交的有效反應(yīng)時(shí)間在3h左右。但為穩(wěn)妥起見，一般將雜交反應(yīng)時(shí)間定為16～20h。當(dāng)然，雜交反應(yīng)的時(shí)間與核酸探針長度與組織通透性有關(guān)?！　∮凶髡咧鲝堧s交反應(yīng)的孵育應(yīng)在黑暗環(huán)境中進(jìn)行，因?yàn)楣饩€會(huì)促進(jìn)甲酰胺的電離作用。,4．雜交嚴(yán)格度（Hybridization stringency） 雜交

29、條件的嚴(yán)格度（stringency）表示通過雜交及沖洗條件的選擇對(duì)完全配對(duì)及不完全配對(duì)雜交體的鑒別程度。錯(cuò)配對(duì)(mismatch）雜交的穩(wěn)定性較完全配對(duì)雜交體差，因此，通過控制雜交溫度、鹽濃度等，可減弱非特異性雜交體的形成，提高雜交的特異性。 雜交的條件愈高，特異性愈強(qiáng)，但敏感性降低。一般來說，低嚴(yán)格度（low stringency）雜交及沖洗條件在Tm -35℃至Tm –40℃之間，高鹽或低甲酰胺濃度。在這種條件下，大約有70

30、%～90%的同源性核苷酸序列被結(jié)合，其結(jié)果是導(dǎo)致非特異性雜交信號(hào)的產(chǎn)生。中嚴(yán)格度，Tm -20℃至Tm-30℃的范圍。高嚴(yán)格度（high stringency）為Tm-10℃至Tm-15℃，低鹽和高甲酰胺濃度。在這種條件下，只有具有高同源性的核苷酸序列才能形成穩(wěn)定的結(jié)合。,由于原位雜交技術(shù)多數(shù)是在Tm-25℃進(jìn)行的，不屬于高嚴(yán)格范圍，無疑會(huì)產(chǎn)生非特異性結(jié)合導(dǎo)致信/噪比減低。在這種情況下，可用加強(qiáng)雜交后處理洗滌的嚴(yán)格度使非特異性的雜交體減

31、少。由于RNA雜交的穩(wěn)定性，應(yīng)用cRNA探針進(jìn)行細(xì)胞或組織的原位雜交時(shí)的雜交溫度比其它核酸探針要高10～15℃。實(shí)驗(yàn)證明，cRNA產(chǎn)生的信號(hào)比雙鏈cDNA要強(qiáng)。單鏈的RNA探針其雜交信號(hào)大于雙鏈的cDNA的約8倍。,5．硫酸葡聚糖（Dextran sulphate）和甲酰胺（formamide） 硫酸葡聚糖是核酸雜交液中僅次于甲酰胺的一種組成成份。在雜交液中，甲酰胺占50%左右，而硫酸葡聚糖占10%左右。它具有極強(qiáng)的水合（hyd

32、rate）作用，能大大增加雜交液的粘稠度。硫酸葡聚糖的主要作用是促進(jìn)雜交率，特別是對(duì)雙鏈核酸探針。這是應(yīng)用硫酸葡聚糖于雜交液中的主要目的?！　〖柞０返闹饕饔迷谡{(diào)節(jié)雜交反應(yīng)溫度方面，從而有助于保持組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。甲酰胺還可防止在低溫時(shí)非同源性片段的結(jié)合，但甲酰胺具有破壞氫鍵的作用從而具有一種不穩(wěn)定的作用。,（四）雜交后處理（post hybridisation treatment）　　雜交后處理包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂

33、洗。通過雜交后的洗滌有效地減低背景染色，獲得較好的反差效果。在雜交后漂洗中的RNA酶液洗滌能將組織切片中非堿基配對(duì)RNA除去。洗滌的條件如鹽溶液的濃度、溫度、洗滌次數(shù)和時(shí)間因核酸探針的類型和標(biāo)記的種類不同而略有差異，一般遵循的共同原則是鹽溶液濃度由高到低而溫度由低到高。必須注意的是在漂洗的過程中，切勿使切片干燥。,（五）顯示（Visualization）　　顯示又可稱為檢測(cè)系統(tǒng)（Detection system）。根據(jù)核酸探針

34、標(biāo)記物的種類分別進(jìn)行放射自顯影或利用酶檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行不同顯色處理?！　〖?xì)胞或組織的原位雜交切片在顯示后均可進(jìn)行半定量的測(cè)定，如放射自顯影可利用人工或計(jì)算機(jī)輔助的圖象分析檢測(cè)儀（computer – assisted image analysis）檢測(cè)銀粒的數(shù)量和分布的差異。非放射性核酸探針雜交的細(xì)胞或組織可利用酶檢測(cè)系統(tǒng)顯色，然后利用顯微分光光度計(jì)或圖像分析儀對(duì)不同類型和數(shù)量的核酸的顯色強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)。,（六）對(duì)照實(shí)驗(yàn)和ISHH結(jié)果的判斷

35、　　和其它實(shí)驗(yàn)方法一樣，并非ISHH的任何陽性信號(hào)都是特異性的，故必須同時(shí)有對(duì)照試驗(yàn)以證明其特異性。對(duì)照試驗(yàn)的設(shè)置須根據(jù)核酸探針和靶核苷酸的種類和現(xiàn)有的可能條件去選定，常用的對(duì)照試驗(yàn)有下列幾種,ISHH對(duì)照試驗(yàn)一覽表核乳膠或非放射性檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)照試驗(yàn)Northern 或Southern印跡雜交法ISHH與免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)合應(yīng)用多種不同的核苷酸探針與同一靶核酸進(jìn)行雜交將cDNA或cRNA探針進(jìn)行預(yù)雜交（吸收試驗(yàn)）與非特異性（載

36、體）序列和不相關(guān)探針雜交（置換試驗(yàn)）將切片應(yīng)用RNA酶或DNA酶進(jìn)行預(yù)處理后雜交應(yīng)用同義RNA探針（Sense probe）進(jìn)行雜交以不加核酸探針雜交液進(jìn)行雜交（空白試驗(yàn)）組織對(duì)照用已知確定為陽性或陰性組織進(jìn)行ISHH對(duì)照應(yīng)用未標(biāo)記探針做ISHH，進(jìn)行對(duì)照,從理論上講，對(duì)照試驗(yàn)設(shè)置愈多其靶核苷酸特異性確定愈可靠，但現(xiàn)實(shí)是不可能的。因此，在上述對(duì)照試驗(yàn)中應(yīng)任選設(shè)至少3～4種用以證實(shí)ISHH結(jié)果的可靠性。比較可靠的對(duì)照試驗(yàn):N

37、orthern 和Southern印跡雜交法。用結(jié)合的免疫組織化學(xué)和ISHH法從蛋白質(zhì)（或多肽）水平和轉(zhuǎn)錄水平在相鄰切片或同一切片中證明同一種多肽和相應(yīng)mRNA共存于同一細(xì)胞中。預(yù)先將切片用DNA酶或RNA酶消化，然后用ISHH技術(shù)證明丟失的是DNA或RNA。 如同免疫組化的吸收試驗(yàn)一樣，事先與特異性的cRNA或cDNA進(jìn)行雜交。再進(jìn)行ISHH，其結(jié)果應(yīng)為陰性。由于同義RNA探針和組織內(nèi)mRNA序列順序是相同的，應(yīng)用其進(jìn)行ISH

38、H，結(jié)果應(yīng)為陰性。檢測(cè)系統(tǒng)的對(duì)照如乳膠或酶顯色系統(tǒng)也應(yīng)在無標(biāo)記探針的情況下進(jìn)行。,ISHH的最大優(yōu)點(diǎn)是它的高度特異性，它可測(cè)定組織、培養(yǎng)的單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞提取物中的核苷酸含量。應(yīng)用高敏感度的放射性標(biāo)記cRNA探針在理想的ISHH的實(shí)驗(yàn)條件下檢測(cè)mRNA，其敏感度可達(dá)到20個(gè)mRNA拷貝/每個(gè)細(xì)胞。由于雙鏈DNA的穩(wěn)定性，在用ISHH定位DNA時(shí)很少發(fā)生丟失，降解。在靶核苷酸序列比較伸展的情況如染色體鋪片，長于2kb的探針可以應(yīng)用。因

39、此，其敏感性高到能夠出在染色體鋪片上，有時(shí)甚至在組織切片上的單個(gè)基因拷貝。正因?yàn)槿绱?，?duì)ISHH結(jié)果的解釋應(yīng)持慎重態(tài)度，特別是前人未報(bào)告過的新發(fā)現(xiàn)。因?yàn)槿缜八?，影響ISHH實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素太多，比如在外科或?qū)嶒?yàn)取材后未及時(shí)的固定或冷凍可由于組織中mRNA的降解而導(dǎo)致假陰性結(jié)果。另外，在各種類型核酸探針進(jìn)入細(xì)胞、組織和各種器官的能力，又叫可接近性（acessiblity）各異。這些諸多因素都將影響ISHH的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。,1、使用地高辛

40、標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行石蠟切片的RNA原位雜交第一天    1） 二甲苯于37℃脫蠟2次，每次15分鐘；    2） 無水乙醇浸泡2次，每次3分鐘；    3） 95%乙醇浸泡2次，每次3分鐘；    4） PBS清洗3分鐘；    5） 2%

41、焦碳酸二乙酯室溫下浸泡10分鐘；    6） PBS清洗10分鐘；    7） 加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育15分鐘；    8） PBS清洗2次，每次3分鐘；    9） 0.2N的HCl孵育30分鐘；    10）PBS清洗2

42、次，每次3分鐘；    11）0.25%無水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分鐘；    12）PBS清洗2次，每次5分鐘；    13）預(yù)雜交緩沖液孵育30分鐘；    14）準(zhǔn)備核酸探針混合物：使用預(yù)雜交緩沖液稀釋探針，85℃加熱5分鐘，置于冰塊中10分鐘；,原位雜交操

43、作流程,15）雜交；第二天    16）將玻片置于SSC中2次，每次5分鐘以去除封片；    17）PBS清洗3分鐘；    18）RNA酶溶液中（或0.1-1ng/mlPBS中），37℃孵育30分鐘；    19）PBS清洗5分鐘；   

44、 20）室溫，2×SSC清洗10分鐘；    21）37℃，1×SSC清洗10分鐘；    22）37℃，0.5×SSC清洗10分鐘；    23）緩沖液孵育10分鐘；    24）緩沖液（1%正常綿羊血清和0.03%Triton

45、X-100）孵育30分鐘；    25）加入抗地高辛抗體，37℃孵育3 小時(shí)；    26）緩沖液清洗2次，每次10分鐘；    27）緩沖液清洗2次，每次5分鐘；    28）制成NBT/BCIP暗處保存30-60分鐘，顯微鏡下進(jìn)行觀察，如果背景尚佳，顯色時(shí)間可延長到16小時(shí)；

46、    29）停止緩沖液的反應(yīng)，用水進(jìn)行簡單的清洗；    30）固紅，脫水以及封片進(jìn)行核的復(fù)染。,2、使用地高辛標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行石蠟切片的原位DNA雜交第一天    1） 二甲苯于37℃脫蠟2次，每次15分鐘；    2） 無水乙醇浸泡2次，每次5分鐘； 

47、;   3） 95%乙醇浸泡2次，每次5分鐘；    4） PBS清洗5分鐘；    5） 2%焦碳酸二乙酯室溫下浸泡10分鐘；    6） PBS清洗5分鐘；    7） 加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育10分鐘；  &#

48、160; 8） PBS清洗2次，每次5分鐘；    9） 0.2N的HCl孵育30分鐘；    10）PBS清洗2次，每次5分鐘；    11）0.25%無水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分鐘；    12）PBS清洗5分鐘；   

49、0;13）預(yù)雜交緩沖液孵育30分鐘；    14）準(zhǔn)備寡核苷酸探針混合物：使用預(yù)雜交緩沖液稀釋探針；,15）雜交；第二天    16）將玻片置于SSC中以去除封片；    17）室溫，2×SSC清洗10分鐘；    18）37℃，1×SSC清洗10分鐘

50、；    19）37℃，0.5×SSC清洗10分鐘；    20）緩沖液孵育10分鐘；    21）緩沖液孵育30分鐘；    22）加入抗地高辛抗體37℃孵育3小時(shí)；    23）緩沖液清洗2次，每次5分鐘；

51、0;   24）緩沖液清洗2次，每次5分鐘；    25）制成NBT/BCIP暗處保存30-60分鐘，顯微鏡下進(jìn)行觀察，如果背景尚佳，顯色時(shí)間可長到16小時(shí)；    26）停止緩沖液的反應(yīng)，用水進(jìn)行簡單的清洗；    27）固紅，脫水以及封片進(jìn)行核的復(fù)染。,,,成年大鼠海馬、齒狀回D

52、AT1mRNA陽性神經(jīng)元,大鼠杏仁外側(cè)核DAT1 mRNA陽性神經(jīng)元,,A 大鼠舌下神經(jīng)核(12)DAT1 mRNA 陽性神經(jīng)元 ×100B 大鼠延髓中央網(wǎng)狀核DAT1 mRNA 陽性神經(jīng)元 ×200,FISH – Fluorescent In Situ Hybridization 熒光原位雜交,,,,探針DNA,加入熒光標(biāo)記,解螺旋，雜交,FISH,例如左圖:通過使用pa

53、inting 探針（針對(duì)16號(hào)染色體)，可以確認(rèn)16號(hào)染色體的一段易位到了9號(hào)染色體。,,使用Vysis AneuVysion探針組對(duì)13, 18, 21, X, Y 染色體進(jìn)行雜交,普通圖像 分類色圖像,5號(hào)染色體上雜交了7種探針，這些探針在位置上分別有部分重疊。,18 條帶,>7 條帶,原始圖像,DAPI圖像,實(shí)例: X / Y 著絲點(diǎn)探針,單個(gè)或多個(gè)全染色

54、體（WCP) 探針,雜交到有爪蟾蜍染色體上的衛(wèi)星探針(SAT1),Multi- color ISH,TMB - chr. 1DAB - chr. 15NF - chr. 7,Courtesy of T. Ried, M. Macville (NIH, NHGRI),多色原位雜交,人類頻譜染色體組型分析,頻譜 FISH,多色原位雜交,實(shí)習(xí)課,實(shí)習(xí)時(shí)間： 共聚焦：1月12日2：30 共聚焦實(shí)習(xí)地點(diǎn)：科研樓10樓，,Tha