雞腫瘤性狀疾病原位雜交診斷技術(shù)的建立與應(yīng)用.pdf

1、雞的腫瘤性疾病包括馬立克氏病(Marek's disease，MD)、禽白血病(Avain leukosis，AL)和網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病(Reticuloendotheliosis，RE)，分別是由馬立克氏病病毒(Marek's disease virus，MDV)、禽白血病病毒(Axian leukosis virus，ALV)和網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒(Reticuloendotheliosis virus，REV)引起。腫瘤病的發(fā)生

2、一方面可以引起雞的腫瘤而死亡；另一方面可以引起雞的免疫功能受到損害，導(dǎo)致免疫抑制，使雞的抵抗力下降，從而并發(fā)或繼發(fā)其他感染，使生產(chǎn)性能下降甚至死亡。當(dāng)前，這三種病在我國(guó)養(yǎng)雞場(chǎng)中都有不同程度的存在，并具有相似的臨床癥狀，臨床上易于混淆。疾病鑒別診斷是疾病控制的前提。本研究主要用原位雜交對(duì)三種腫瘤病進(jìn)行鑒別診斷，并對(duì)其相關(guān)基因的序列進(jìn)行測(cè)序和分析，主要內(nèi)容及結(jié)果報(bào)告如下： 1.根據(jù)GeneBank中MDV、ALV-J和REV基因序列

3、，設(shè)計(jì)并合成三對(duì)引物，對(duì)保存的陽(yáng)性病料進(jìn)行擴(kuò)增，并經(jīng)測(cè)序確定其特異性。然后將PCR產(chǎn)物亞克隆到pSPT18，經(jīng)DIG標(biāo)記得到針對(duì)三種腫瘤病的特異cRNA探針。 2.將收集的病料制成石蠟切片，和以前保存的切片一起，加入特異性探針進(jìn)行原位雜交，結(jié)果在切片上可以看到清楚的陽(yáng)性信號(hào)。對(duì)32份疑似腫瘤病料進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合切片HE染色，發(fā)現(xiàn)MDV陽(yáng)性率為25.00％(8/32)，ALV-J陽(yáng)性率為18.75％(6/32)，REV陽(yáng)性率為3.1

4、3％(1/32)。 3.根據(jù)GeneBank中MDV、ALV-J和REV基因序列，設(shè)計(jì)出MDV meq基因的特異引物和ALV、REV env基因的引物，將擴(kuò)增出的基因克隆入pMD18-T載體篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果和國(guó)內(nèi)外發(fā)表毒株進(jìn)行序列比對(duì)分析。結(jié)果表明，所測(cè)MDVmeq 1020個(gè)堿基，編碼340個(gè)氨基酸；其核苷酸與參考毒株間同源性在98.6％～99.8％之間，氨基酸同源性在96.5％～99.4％之間。本研究序列親

5、緣關(guān)系很近，同源性在99.5％～99.6％之間。與0095親緣關(guān)系較近，與GA、648和N親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。 所測(cè)ALV-J gp85有921個(gè)堿基，編碼307個(gè)氨基酸，其核苷酸與參考毒株同源性在86.8％～97.5％之間；gp37有591個(gè)堿基，編碼197個(gè)氨基酸，其核苷酸與參考毒株同源性在93.7％～98.3％之間。gp85推導(dǎo)氨基酸同源性在84.0％～95.4％之間，gp37推導(dǎo)氨基酸同源性在89.8％～98.0％之間。本研究

6、序列親緣關(guān)系較近，同源性在94.4％～98.7之間。與GD06SL1和GD06SL2親緣關(guān)系較近，與ADOL-7501親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。 所測(cè)的REV部分env序列有477個(gè)堿基，編碼159個(gè)氨基酸，此部分env同源性在94.3％～100％之間，其推導(dǎo)氨基酸同源性在87.3％～100％之間。本研究毒株和APC-566親緣關(guān)系較近，與SNV親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。 本研究建立了原位雜交技術(shù)檢測(cè)雞三種腫瘤性疾病的方法，并進(jìn)行了初步應(yīng)用，對(duì)