核酸分子雜交技術(shù)ppt課件

1、核酸分子雜交技術(shù),李如波中國醫(yī)科大學法醫(yī)學院,核酸分子雜交技術(shù)(Nucleic acid molecular hybridization)是檢測核酸分子間序列同源性的一種技術(shù)。不同來源的核酸單鏈只要彼此間有一定的互補序列，即可按堿基配對規(guī)則以氫鍵相結(jié)合。通常是先對一種核酸進行標記（如放射性同位素35S，32P或生物素等）作為探針，去探測另一種核酸序列。核酸分子雜交可以在DNA與DNA，RNA與RNA，或DNA與RNA之間進行。由于這種

2、技術(shù)具有高度的特異性和靈敏性，已廣泛應(yīng)用于生物學、醫(yī)學科學研究，臨床傳染病和遺傳病的診斷。,一、核酸分子雜交的基本原理 從化學和生物學意義上理解，探針(Probe)是一種分子，它帶有供反應(yīng)后檢測的合適標記物，并僅與特異靶分子反應(yīng)?？乖?抗體、外源凝集素-碳水化合物、親和素-生物素、受體-配體(ligand)以及互補核酸間的雜交均屬于探針-靶分子反應(yīng)。蛋白質(zhì)探針（如抗體）與特異靶分子是通過混合力（疏水、離子和氫鍵）的作用

3、在少數(shù)特異位點上的結(jié)合，而核酸探針與互補鏈的反應(yīng)則是根據(jù)雜交體的長短不同，通過氫鍵在幾十、幾百甚至上千位點上的結(jié)合。核苷酸經(jīng)某一原子、功能基團或長側(cè)鏈修飾后仍有可能進行堿基配對，這取決于修飾的部位和修飾物的性質(zhì)。標記的探針每1kb只摻入10-30個修飾堿基，僅4％-12％的單個堿基被修飾的類似物取代了。盡管摻入位點外的堿基配對較弱或不存在，但對整個雜交分子的穩(wěn)定性影響很小。,原位雜交原理示意圖,二、核酸探針的種類根據(jù)標記方法不同可分為

4、： 放射性探針； 非放射性探針兩大類，根據(jù)核酸的性質(zhì)不同又可分為： DNA探針 RNA探針 cDNA探針 cRNA探針 DNA探針還有單鏈(ssDNA)和雙鏈(dsDNA)之分。所以原位雜交可分為DNA-DNA，cDNA-RNA，RNA-RNA和寡核苷酸與DNA或RNA等雜交方式。,三、核酸探針的標記和檢測 最早采用也是目前最常用的核酸標記方法是

5、放射性同位素標記，常用的放射性同位素有32P和35S，前者能量高，信號強，最常用。放射性同位素探針雖然靈敏性高，但卻存在輻射危害和半衰期限制。由于存在上述缺點，近年來，人們在尋求非放射性標記物方面取得了很大進展。國際上已有多家公司相繼推出多種非放射性探針標記試劑盒，在國內(nèi)也具備生物素類標記物的生產(chǎn)能力，并有相應(yīng)試劑出售。目前非放射性標記物有以下幾類：金屬如Hg；熒光物質(zhì)如FITC；半抗原如地高辛（DIG）；生物素；酶類如辣根過氧化物酶（

6、HRP）；半乳糖苷酶或堿性磷酸酶（AKP）等。,四、核酸標記方法及其顯示方法（一）核酸探針的放射性標記技術(shù)1. 缺口平移標記方法 其原理是首先用DNA酶在雙鏈DNA探針的一條鏈上制造一個缺口（nick），缺口處形成3’-羥基末端，在大腸桿菌DNA聚合酶I的催化下將核苷酸殘基加在3’-羥基本上。同時根據(jù)大腸桿菌DNA聚合酶I的5’→3’ 核酸外切酶活性，此酶將缺口5’端核苷酸依次切除，其結(jié)果是在缺口的5’端不斷消除核

7、苷酸而在3’端則依次添加核苷酸，從而使缺口沿著互補DNA鏈移動，故稱缺口平移（nick transcription）。根據(jù)這個原理，用α-32P dATP置換先前存在的核苷酸，則可制備高活性的DNA探針，能滿足大多數(shù)雜交的要求。,圖9－1 利用E. coli DNA聚合酶的切口平移反應(yīng)用 DNase I 處理可將單鏈切口引入DNA。大腸桿菌DNA聚合酶I（Pol I）則結(jié)合到雙鏈DNA的切口或缺口處，Pol I的5’→3’外切核酸酶活

8、性可將DNA一條鏈的核苷酸除去，產(chǎn)生同時合成DNA延伸鏈的模板。然后，沿著DNA分子，通過5’→3’外切核酸酶和5’→3’聚合酶的聯(lián)合作用，最初的切口被翻譯。如圖所示，通過DNA聚合酶的作用，在dNTP存在的情況下，反應(yīng)中雙鏈DNA的上一條鏈的切口從左到右被翻譯。雙鏈DNA的下一條鏈中，切口平移為從右到左進行。波浪形箭頭代表新合成DNA鏈的片段。,2. DNA快速核酸標記 大腸桿菌聚合酶I經(jīng)枯草桿菌酶切割可得到兩條多

9、肽鏈，其中分子量為76kD的大片斷稱為Klenow片段。該酶具有完整聚合酶I的5’→3’ 核酸聚合酶活性和3’→5’ 核酸外切酶活性，但缺乏5’→3’ 核酸外切酶活性。利用Klenow片段可以填補由限制性酶消解DNA所產(chǎn)生的3’凹陷末端。因此，用這種方法可以標記雙鏈DNA的凹陷3’末端。用Klenow片段標記末端一般只用一種[α-32P] dNTP，加入反應(yīng)的[α-32P] dNTP取決于延伸的5’末端序列。,3. 用T4多核苷酸激酶標

10、記DNA5’末端 寡核苷酸探針或短的RNA和DNA探針可選用此方法。T4多核苷酸激酶(polynucleotide kinase, PNK)是由T4噬菌體感染的大腸桿菌中提取的，此酶能催化ATP的γ-磷酸轉(zhuǎn)移至DNA或RNA的5’-OH末端。在過量ADP存在時，也可促進磷酸交換反應(yīng)，使PNK將DNA末端5’磷酸轉(zhuǎn)移到5ADP上生成ATP，然后催化[α-32P] dNTP上的標記磷酸轉(zhuǎn)移至DNA的5’末端，從而使DNA重新

11、磷酸化，并得到標記。注意要用堿性磷酸酶去掉磷酸基團。,4. 隨機引物延伸標記方法是從單鏈DNA或RNA模板合成高比活性的32P標記探針所選用的方法。原理是使長6-8nt的寡核苷酸片段與變性的DNA或RNA模板退火，在DNA聚合酶I的作用下，以每一個退火到模板上的寡核苷酸片段為引物引發(fā)DNA鏈的合成，在反應(yīng)時將α-32P dNTP摻入合成鏈，即得到標記。變性處理后，新合成鏈（探針片段）與模板解離，即得到無數(shù)各種大小的探針DNA。因為所用

12、真核苷酸片段很短，在低溫條件下可與模板DNA隨機發(fā)生退火反應(yīng)，因此，被稱為隨機引物(random primer)。這種隨機引物可用小牛胸腺DNA或魚精DNA制備。,5. 聚合酶鏈反應(yīng) 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)是一種分子生物學新技術(shù)，由于美國Cetus公司人類遺傳學部的Kary B. Mulli于1985年創(chuàng)立。該技術(shù)利用兩個與相反鏈雜交并隨著于靶DNA兩側(cè)的寡核苷酸

13、引物經(jīng)酶促合成特異的DNA片斷，包括膜板變性、引物退火和引物延伸三個步驟的反復(fù)循環(huán)，最終兩引物所夾靶DNA得到千萬倍以上的擴增?？捎脕順擞浉弑然钚缘腄NA探針，PCR技術(shù)有很高的特異性，可以在1-2小時內(nèi)大量合成探針DNA片斷。如果在底物中加入[α-32P] dNTP或其它標記的dNTP，則探針DNA合成過程中可得到很好的標記，標記物摻入率可高達70％-80％。PCR標記技術(shù)特別適用于大規(guī)模檢測和非放射性標記。該法的特點是要合成一對特異

14、性PCR引物。,6. 體外轉(zhuǎn)錄法 先把DNA片段克隆到有噬菌體轉(zhuǎn)錄啟動子的載體中，然后在RNA聚合酶的作用下，以DNA為模板，以含有標記的三磷酸核糖核苷為原料，對啟動子下游的序列進行轉(zhuǎn)錄，所謂啟動子(promotor)，又稱啟動基因，是入出境DNA分子上可與RNA聚合酶特異性結(jié)合而使轉(zhuǎn)錄開始的部位，而啟動子本身并不被轉(zhuǎn)錄。 體外轉(zhuǎn)錄常用的噬菌體轉(zhuǎn)錄啟動子有沙門氏菌噬菌體SP6和大腸桿菌噬菌體T3，T7。當

15、二個不同的噬菌體轉(zhuǎn)錄啟動子結(jié)合在載體多克隆位點的兩側(cè)，而且互相呈相對方向時，則可分別啟動插入DNA片段Sense和Antisense的轉(zhuǎn)錄。 轉(zhuǎn)錄前要用限制酶先在cDNA插入點的下游切割，使DNA直線化，做為模板，以標記的三磷酸核糖核苷為原料，轉(zhuǎn)錄合成RNA探針。,（二）核酸探針的非放射性標記技術(shù)1. 光敏生物素標記核酸 有二種光敏生物素：均由一個光敏基團、一個鏈接臂和一個生物素基團組成。光生物素：光

16、敏基團是-N3，在光作用下可與核酸中的堿基結(jié)合。補骨脂素生物素：光敏基團是補骨脂素，在光照（320-400μm）下，可與單鏈或雙鏈DNA發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)主要在T上，C上也有一定程度的反應(yīng)。 光敏生物素的連接臂含有6-12個碳原子，用以減少探針雜交時的空間位阻。此方法簡單，靈敏度可達ng水平 ，可用于外源基因的檢測。,2. 酶促生物標記核酸 以生物素化的脫氧核苷三磷酸（Bio-11-dUTP, Bio-7

17、-dATP, Bio-11-dCTP）等代替相應(yīng)32P標記的脫氧核苷三磷酸，以DNA聚合酶作用摻入DNA。Bio-dUTP代替dTTP，Bio-dATP代替dATP，Bio-CTP代替dCTP。Bio-11-dUTP的11是指生物素基團與脫氧核苷酸之間連接臂的碳鏈長度。常用的酶促生物標記DNA的方法有缺口平移法和隨機引物延伸法。,3. 寡核苷酸的生物素末端標記5’-磷酸的化學標記法： 將寡苷酸的5’-磷酸接上一個乙二

18、胺，然后用琥珀亞胺生物素，將生物素基團連接到磷酸酰胺基上。3’-OH的酶捉標記法： 用末端轉(zhuǎn)移酶將Bio-11-dUTP加于其3’-OH端，脫去一個焦磷酸。4. 酶標DNA標記試劑：辣根過氧化物酶（HRP）；堿性磷酸酶（AP） 通過對苯醌（PBQ）與聚乙烯亞胺（PEI）連接而成（HRP-PBQ-PEI+），此試劑在戊二醛的作用下與變性的DNA結(jié)合，使HRP與DNA連接在一起，組成HRP標記的DNA探針

19、。,5. 酶標寡核苷酸核苷酸5’-末端標記HRP法： 在HRP中產(chǎn)生一個-SH反應(yīng)基團，在寡苷酸合成終了加在5’-端，帶一個C6的-HS，與活化的HRP反應(yīng)生成5’-HRP寡苷酸。內(nèi)中標記AP法： 在合成寡核苷酸過程中將一個5’帶連接臂及CF3基團的尿苷3’亞磷酰亞胺合成在寡核苷酸鏈中，合成后此活化的寡核苷酸與AP即得到AP標記的寡核苷酸。6. DNA半抗原標記 其原理與Bio-11

20、-dUTP相同 ，只是用毛地黃甙抗體檢測標記在DNA上的半抗原分子地高辛（Digoxigenin，DIG）。,（三）非放射性探針的顯示體系1. AP顯色體系A(chǔ)SO-AP+BCIP→BCI-OH+PiBCI-OH+NBT→紫色ASO：等位基因特異的寡核苷酸BCIP：5溴-4氯-3吲哚磷酸NBT：四氮唑藍Pi：磷酸2. HRP顯色體系HRP+H2O2→[HRP?H2O2]ODA-NH2+[HRP?H2O2] →ODA-N

21、=ODA/棕色↓ +HRP+H2OODA；鄰-聯(lián)茴香胺,3. ABC顯色體系DNA-B+SA-AP→DNA-B-SA或DNA-B+SA+BAP→DNA-B-SA-BAPSA：streptavidin(鏈霉親合素)BAP：生物素化的磷酸酶B：biotin(生物素), ABC:avidin-botin-enzyme complex(親合素-生物素-酶復(fù)合物)。4.非放射發(fā)光身顯影若將AP或HRP的顯色底物根據(jù)光化學原理換成一

22、種酶解后產(chǎn)生的光子的化合物，可用自顯影技術(shù)曝光X線片顯示。,HRP發(fā)光自顯影：氨基苯-甲酰肼在HRP與H2O2作用下氧化為氨基苯二甲酸，同時放出N2及發(fā)光。AP發(fā)光自顯影：發(fā)光底物金剛烷二氧丁環(huán)磷酸鹽（AMPDD），其磷酸二脂鍵在AP作用下水解一個磷酸，進而由分子內(nèi)過氧鍵提供能源分解并產(chǎn)生金剛酮和激發(fā)態(tài)的甲基間-氧苯甲酸陰離子，恢復(fù)到基態(tài)時發(fā)光。,五、核酸分子雜交方法和類型（一）、固相膜核酸分子雜交 將參加反應(yīng)的

23、一條核酸鏈先固定在固體支持物上，一條反應(yīng)核酸游離在溶液中，固體支持物有硝酸纖維素濾膜、尼龍膜、乳膠顆粒，磁珠和微孔板等。雜交后未雜交的游離片斷容易洗去，膜上留下的雜交物容易檢測能防止和DNA自我復(fù)性等優(yōu)點，故該法最為常用。其類型有：菌落原位雜交、斑點雜交、狹縫雜交、Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、細胞或組織原位雜交和夾心雜交等。,方法：1. DNA變性：變性能使DNA雙鏈解開，常用SSC（0.1mol/L SSC,

24、 15mmol NaCl-1.5mmol 檸檬酸三鈉）堿變性。2. 膜上固定： 20×SSC中轉(zhuǎn)膜-毛細現(xiàn)象，固定，80℃下，2小時或紫外線下1分鐘（Cross link）。3. 預(yù)雜交：塑料袋中預(yù)熱60℃，預(yù)雜交液中：6×SSC，0.01molEDTA，5×Denhardt氏液，0.5％SDS，100 μg/ml變性鮭魚精DNA4. 雜交：雜交液中的組成：6×SSC，0.01molEDTA

25、，5×Denhardt氏液，0.5％SDS，100 μg/ml變性鮭魚精DNA及探針。5. 洗膜：2×SSC-0.5％SDS， 0.1×SSC-0.5％SDS，60℃ 2小時。6. 顯色：放射自顯影；感光顯影。,種類：A：菌落原位雜交(Colony in situ hybridization)：是將細菌從培養(yǎng)平板中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后再將濾膜上的菌落裂解以釋放出DNA。將DNA烘干固定膜上與標記

26、的探針雜交，放射自顯影，檢測雜交信號，與平板上的菌落對位。B：斑點雜交(Dot blot)：是將被檢標本點到膜上，烘烤固定，簡便，快速，可做半定量分析，一張膜上可同時檢測多個樣品。,C： Southern 印跡雜交(Southern blot)：將DNA標本用限制性內(nèi)切酶消化后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電脈分離各酶解片斷，然后經(jīng)堿變性，Tris緩沖液中和（及）高鹽下通過毛細作用，將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維濾膜上，烘干后即可用于雜交。雜交后放射

27、自顯影顯示與探針互補的DNA酶解片斷。是研究DNA圖譜的基本技術(shù)，在遺傳病診斷、DNA圖譜分析及PCR產(chǎn)生分析生平方面有重要價值。D：Northern印跡雜交(Northern blot)：是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上的方法。轉(zhuǎn)印方法與DNA相似，但是在進樣前用甲醛使RNA變性，而不用NaOH，因為會水解RNA的2’-羥基團。,E：組織原位雜交：簡稱原位雜交，指組織或細胞的原位雜交，組織或細胞經(jīng)適當?shù)奶幚砗笫辜毎ㄍ?/p>

28、性增加，讓探針進行細胞與DNA或RNA雜交，因此可以確定探針的互補序列在細胞內(nèi)的空間定位，具有重要的生物學和病理學意義。染色體DNA雜交可顯示特定序列在染色體上的定位，與RNA雜交或顯示特定RNA在細胞中或組織中的定位。探針可以是雙鏈或單鏈DNA，也可是RNA探針。長度以100-400nt為宜。寡核苷酸探針（16-30nt）能自由地出入細胞和組織細胞壁，雜交效率明顯高于長探針，是優(yōu)選探針。,（二）、液相雜交 參加反應(yīng)的

29、兩條核酸鏈都在溶液中，是一種最早且操作簡便的雜交類型，雖有時被應(yīng)用，但不如固相雜交普遍，其原因是雜交后的過量未雜交探針在溶液中去除較為困難和誤差較高。近來有商業(yè)性基因探針診斷盒的應(yīng)用。,原位核酸分子雜交技術(shù),原位核酸分子雜交技術(shù)簡稱原位雜交(in situ hybridization)，是應(yīng)用已知堿基順序并帶有標記物的核酸探針與組織、細胞中待檢測的核酸按堿基配對的原則進行特異性結(jié)合而形成雜交體，然后再應(yīng)用與標記物相應(yīng)的檢測系統(tǒng)，通過組織

30、化學或免疫組織化學方法在被檢測的原位形成帶顏色的雜交信號， 在顯微鏡或電子顯微鏡進行細胞內(nèi)定位。這一技術(shù)為研究單一細胞中DNA和編碼各種蛋白質(zhì)、多肽的相應(yīng)mRNA的定位提供了手段。使從分子水平研究細胞內(nèi)基因表達及有關(guān)基因調(diào)控提供了有效的工具，視為組織化學或免疫細胞化學中革命性的突破。,原位雜交技術(shù)已應(yīng)用于基礎(chǔ)研究如基因組圖(gene mapping)，轉(zhuǎn)基因檢測，基因表達定位(localization of gene expressio

31、n) ,核DNA和RNA的mRNA的排列和運輸(arrangement and transport of mRNA)，復(fù)制(replication)和細胞的分類(sorting of cells)。臨床應(yīng)用在細胞遺傳學(cytogenetics)，產(chǎn)前診斷(prenatal diagnosis)，腫瘤和傳染性疾病的診斷，生物學劑量測定(biological dosimetry)和病毒學的病源學診斷等。,一、原位核酸分子雜交技術(shù)的發(fā)展

32、 原位雜交1969年由美國耶魯大學Gall和Pardue首先創(chuàng)立的，他們用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細胞雜交，確定該基因定位于卵母細胞的核仁中。與此同時，Buogiorno-Nardelli和Amaldi，John及其同事等相繼利用同位素標記核酸探針進行了細胞或組織的基因定位。Ortho（1970）應(yīng)用3H標記的兔乳頭狀瘤病毒cDNA探針在兔乳頭狀瘤組織的冰凍切片進行雜交，首次用原位雜交技術(shù)檢出了病毒DNA在細胞中的定位

33、。,由于同位素標記探針具有放射性，既污染環(huán)境，又對人體有害，且受半衰期限制等缺點，因此研究用非放射性標記物標記核酸探針進行原位雜交，引起許多學者的重視和探索。Bauman（1981）等首先用熒光素標記cRNA探針做原位雜交，然后用熒光顯微鏡觀察獲得了成功。Shroyer(1982)報導用2，4二硝基苯甲醛（DNP）標記DNA，使該DNA探針具有抗原性，然后用兔抗DNP的酶標抗體來識別雜交后探針，最后經(jīng)免疫過氧化物酶組織化學的方法顯示雜交

34、信號。,Brigat(1983)首先創(chuàng)立生物素標記的探針在組織切片上檢出了病毒DNA，通過生物素與抗生物素結(jié)合，過氧化物酶顯示系統(tǒng)顯示病毒DNA在細胞中的定位，生物素標記探針技術(shù)目前已被廣泛應(yīng)用，特別是在病毒學和病理學診斷中。 Boeringer-Mannhem Biochemisca (Roche)于1987年將地高辛標記的有關(guān)試劑和藥盒投放市場，和其它非放射性標記物一樣，地高辛較放射性標記系統(tǒng)安全，方便、省時。同時在

35、敏感性和質(zhì)量控制方面比生物素標記要優(yōu)越，地高辛標記法顯示的顏色為藍色（標記堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶顯色系統(tǒng)），有較好反差背景，更有利于與免疫組織化學相結(jié)合，同時可以檢測基因表達。,二、 原位分子雜交技術(shù)的基本方法基本方法包括：雜交前準備：包括固定、取材、玻片和組織的處理，增強核酸探針的穿通性和減低背景染色等；2. 雜交；3. 雜交后處理；4. 顯示：包括放射性自顯影和非放射性標記的組織化學或免疫組織化學顯色。,（一）、固定

36、 固定的目的是為了保持細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，最大限度地保存細胞內(nèi)的DNA或RNA的水平；使探針容易進入細胞或組織。DNA比較穩(wěn)定，mRNA易被酶降解。所以取材后應(yīng)盡快冰凍或固定。1. 最常用多聚甲醛固定液，因其不會與廣泛的交叉連接，不會影響探針穿透入細胞或組織。2. mRNA原位雜交時應(yīng)將組織固定于4％多聚甲醛磷酸緩沖液中1-2h，在冰凍前浸入15％蔗糖中4℃過夜，次日切片或保存于液氮中。,3. 組織也可在取材后直接置于液

37、氮中冷凍，切片后將其浸入4％多聚甲醛約10min空氣中干燥后保存于-70℃，可保存數(shù)月。4. 福爾馬林固定、石蠟包埋的切片對檢測DNA或mRNA有時也可獲得雜交信號，但由于與蛋白質(zhì)交聯(lián)的增加，影響核酸探針的穿透，因而雜交信號常低于冰凍切片。同時在包埋的過程中可減低mRNA的含量。,（二）、玻片和組織切片的處理1. 玻片的處理：洗滌劑浸泡，清水沖洗；弱酸中浸泡，沖洗；酒精中浸泡，沖洗，最后蒸餾水沖洗，烘干，高熱滅菌。粘附劑涂片：有三種

38、： 鉻礬-明膠液； 多聚賴氨酸（Poly－L－Lysine） ； APES(3-amino propyltriethoxy salane，氨丙基三乙氧基硅烷)。 一般2％APES丙酮液中浸泡10秒，然后丙酮中洗1分鐘。,2. 增強組織的通透性和核酸探針的穿透性常用的方法：應(yīng)用稀釋的酸洗滌；去垢劑(detergent)或稱清洗劑，如Triton-X 100或某些消化酶，如蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白

39、酶、膠原蛋白酶和淀粉酶(diastase)等。注意不要過度。蛋白酶K(proteinase K)的消化作用的濃度及孵時間視組織種類、應(yīng)用固定劑的種類、切片的厚薄而定。一般應(yīng)用1μg/ml（于0.1mol/L Tris-50mmol/L EDTA，pH8.0中）， 在37℃下孵育15-20分鐘。,3. 減低背景染色：雜交后的酶處理和洗滌均有助于減低背景顏色。在多聚甲醛固定后浸入乙酸酐(acetic anhydride)和三乙醇胺(trie

40、thanolamine)中以減低靜電效應(yīng)，減少探針對組織的非特異性背景染色。預(yù)雜交是減低背景染色的一種有效手段，預(yù)雜交液與雜交液的區(qū)別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖(dextran sulphate)，可達到封閉非特異性的雜交目的，減低背景染色。在雜交后洗滌中用低濃度的RNA酶溶液（201μg/ml）洗滌一次，以減低殘留的內(nèi)源性的RNA，減低背景染色。4. 防止RNA酶的污染：整個實驗過程戴消毒手套，器具高溫消毒（240℃）。溶液配制用

41、DEPC水。,（三）、雜交： 雜交(hybridization)是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片，或用無菌的蠟?zāi)ご婀杌纳w玻片，防止孵育過程中雜交液的蒸發(fā)。切片放于5×SSC或 2×SSC溶液的濕盒中進行孵育。SSC：(standard saline citrate)（四）、雜交后處理：不同溫度，不同鹽濃度的漂洗。一般的原則是鹽溶液濃度由高到低而溫度由高到低。注意漂洗過程中切勿干燥。（

42、五）、顯示（檢測系統(tǒng)）前述,（六）、對照實驗和結(jié)果的判定1. 將cDNA與cRNA探針進行雜交（吸收實驗）2. 與非特異性（載體）序列和不相關(guān)探針雜交（置換實驗）3. 將切片用RNA酶或DNA酶進行預(yù)處理后進行雜交，用同義探針(sense probe)進行雜交。4. 以不中核酸探針雜交液進行雜交（空白實驗）。5. 組織對照用已知確定為陽性或陰性組織進行雜交對照。6. 用未標記探針雜交，進行對照。,三、 RNA原位核酸雜交方法

43、（一）、基本原理 是指運用cRNA或寡核苷酸等探針檢測細胞或組織內(nèi)RNA表達的一種原位雜交技術(shù)?；驹硗笆雠cDNA雜交區(qū)別：1. 探針不同，避免了應(yīng)用雙鏈DNA探針在雜交反應(yīng)中兩條鏈的復(fù)性與第二條鏈竟爭性雜交；RNA雜交體穩(wěn)定，雜交后RNA酶洗脫，特異性強。2. 檢測目的不同：內(nèi)源性基因如細胞內(nèi)固有基因、異?；蚝妥儺惢蚝屯庠葱曰?，如細菌或病毒 3. 有較高的靈敏度。,不足之處：1. 不同種類探針的

44、選擇、制備和標記要適合靶核酸和組織的特點；2. 有效制止組織和細胞內(nèi)RNA降解；3. 實驗過程中嚴防RNA酶污染；4. 對雜交信號有效的放大和技巧；5. 陽性結(jié)果的判定，不僅要有陽性或陰性標本對照，有條件的還觀察Northern雜交和免疫組織化學對同一組織的冰凍切片或石蠟切片中，基因及其產(chǎn)物兩者表達之間關(guān)系；6. 實驗過程中熟練運用技術(shù)是雜交成功的關(guān)鍵。,（二）、RNA探針種類：1. cRNA探針：是以cDNA為模板，通過

45、體外轉(zhuǎn)錄獲得。2. 寡核苷酸探針：以核苷酸為原料，通過DNA合成儀合成。標記：1. 酶反應(yīng)法：末端標記法，將標記物導入線型DNA或RNA的5’端或3’端的一種標記法，一般攜帶的標記分子較少。,2. 體外轉(zhuǎn)錄法：是一種與克隆片段序列相同的單RNA探針的方法。先將靶核苷酸序列克隆到含噬菌體轉(zhuǎn)錄啟動子的載體中，然后在RNA聚合酶的作用下，以DNA為模板， 以含有標記的三磷酸苷為原料，對啟動子下游的序列進行轉(zhuǎn)錄，而啟動子本身并不轉(zhuǎn)錄。如大

46、腸村菌噬菌體T3，T7，SP6。當兩個不同的噬菌體轉(zhuǎn)錄啟動子結(jié)合在多克隆位點的兩側(cè)，用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶在插入序列的下游將持粒線性化，在4 種三磷酸核糖核苷的相應(yīng)的噬菌體RNA聚合酶的存在下，即轉(zhuǎn)錄成RNA。如反應(yīng)物中有標記的三磷酸核糖核苷，所有的RNA易被標記。常用的非放射性標記技術(shù)有：生物素、地高辛（DIG）、堿性磷酸酶（AP）、辣根過氧化物酶（HRP）和熒光素。,圖9-2 用噬菌體編碼的RNA聚合酶體外合成RNA將待轉(zhuǎn)錄的DNA

47、片段克隆入多克隆位點區(qū)的限制性位點中，多克隆位點的兩側(cè)帶有兩個噬菌體聚合酶啟動子（通常為T7和SP6）。用可切割轉(zhuǎn)錄區(qū)下游的限制性內(nèi)切核酸酶酶切使DNA線性化，以防止環(huán)狀模板DNA多聚轉(zhuǎn)錄物的合成。將適當?shù)木酆厦讣皉NTP加入適宜的緩沖液時，即可從靠近插入物的啟動子開始轉(zhuǎn)錄?；パa于一條模板鏈的RNA產(chǎn)物的長度與轉(zhuǎn)錄的啟動子及線性DNA至靶序列末端之間的距離相等。反應(yīng)結(jié)束時，用無RNA酶的DNA酶消化除去DNA模板，DNA酶消化后產(chǎn)生的未

48、摻入的核苷酸和寡脫氧核著酸可通過 Sephadex G-75層析除去。,純化：為了去除在探針標記過程中未被標記的剩余dNTP等小分子，常用乙醇沉淀法或酚/氯仿抽提法進行純化。 1. 乙醇沉淀法的原理：DNA可被乙醇沉淀，而未摻入DNA的dNTP則保留在上清中，由些反復(fù)乙醇沉淀能將兩者分開。 2. 酚/氯仿抽提法：交替使用酚、氯仿這兩種不同的蛋白質(zhì)變性劑，能將溶液中的蛋白質(zhì)除去。,水解：RNA探針的長度以5

49、0-150堿基為佳，探針易進行入細胞，雜交率高，雜交時間短。合成長的探針需要水解成短的探針。試劑：40mM NaHCO3+60mM Na2CO37M NH4OAc+EtoH時間：溫度：60℃ Lf - LoT = ─────── K ? Lf ? LoK= 0.11 kb/minLf: 原檢測基因的長度（已合成的探針的長度）kbLo: 要水解的探針的長度 kb,BCL-

50、2 ISH Detection KitBCL－2原位雜交檢測試劑盒使用說明書產(chǎn)品編號：HK1050 保存：置4℃工作量：100張切片 有效期：一年 BCL-2是主要的抗凋亡基因。本試劑盒采用針對人、大鼠、小鼠的BCL-2特異性寡核苷酸探針，經(jīng)地高辛標記。由于采用多相寡核苷酸探針和高敏感標記技術(shù)，并配合使用敏感性加強型的原位檢測方法，具有敏感性特別高，背景清晰，結(jié)果準確可靠的優(yōu)點。可以檢測出常規(guī)福爾馬林固定

51、，石蠟包埋標本的BCL-2 mRNA序列。,針對人的BCL-2的寡核苷酸探針序列：5’TGCGA CAGCT TATAA TGGAT GTACT TCATC3’；5’GTGAA GGGCG TCAGG TGCAG CTGGC TGGAC3’；5’AGGTG CCGGT TCAGG TACTC AGTCA TCCAC3’。 上述序列和大鼠、小鼠的序列僅3bp/90bp不同。兔和人序列基本相同。適用種屬: 人、大鼠、

52、免、小鼠組織。,試劑盒中內(nèi)容：胃蛋白酶（×10；Pepsin）2ml；2. 預(yù)雜交液2ml；3. BCL-2寡核苷酸探針雜交液 2ml；4. 封閉液5ml；5. 生物素化鼠抗地高辛5ml；6. SABC-POD 5ml；7. 生物素化過氧化物酶5ml。用戶自備試劑：原位雜交專用蓋玻片（博士德有售）：POLY－L－LYSINE；DEPC；20%甘油緩沖液（3%檸檬酸，1×SSC，0.5

53、15;SSC, 0.2×SSC, 0.5M PBS）,一、培養(yǎng)細胞和冰凍切片準備工作：緩沖液的配備3％檸檬酸：100ml蒸餾水中加檸檬酸（C6H8O7?H2O）3g，pH 2.0左右。2×SSC：1000ml蒸餾水中加氫化鈉17.6g，檸檬酸三鈉（C6H5O7Na3?2H2O，分子量294）8.8g。0.5×SSC：300ml蒸餾水加100ml 2×SSC即可。0.2×SSC：

54、270ml蒸餾水加30ml 3×SSC即可。20％甘油：20ml甘油加80ml蒸餾水即可。0.5M PBS：1000ml蒸餾水加氯化鈉30g，Na2HPO4?12H2O 6g，NaH2PO4?2H2O 0.4g，pH7.2-7.6。,操作程序：注意：最重要的是及時固定，并在固定液中加入0.1％的DEPC處理，以抑制RNA酶對mRNA的分解作用。此外，過度固定對原位雜交有明顯的不利影響。1. 玻片的處理： 一般采用多聚賴氨

55、酸或APES。切片厚度20μm。2. 細胞在多聚賴氨酸處理的蓋玻片上進行培養(yǎng)，條件為37℃和5％的CO2，所用培養(yǎng)基為Dubecco基礎(chǔ)培養(yǎng)基。細胞長好后0.1M PBS（pH 7.4）洗2分鐘×3次。3. 培養(yǎng)細胞和冰凍切片均可用下述方法固定：固定液為4％多聚甲醛／0.1M PBS（pH 7.2-7.4），含有1／1000 DEPC。室溫固定 30-60分鐘。蒸餾水充分洗滌，干燥后-20℃冰凍可保存2周以上。,4. 新鮮

56、配制0.5％H2O2／甲醇室溫處理30分鐘以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。蒸餾水洗滌3次。5. 暴露mRNA核酸片段：切片上摘加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶（1ml 3%檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻），37℃消化30-120秒鐘。有時也可以不消化。0.5M PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。6. 預(yù)雜交：濕盒的準備：干的雜交盒底部加20％甘油20ml以保持濕度。按每張切片加20 μl預(yù)雜交液。恒溫箱37-40℃ 24小時。

57、吸取多余液體，不洗。7. 雜交：按每張切片20μl雜交液，加在切片上。將原位雜交專用蓋玻片的保護膜揭開后，蓋在切片上。恒溫箱40-42℃雜交過夜。,9. 滴加封閉液：37℃30分鐘。甩去多余液體，不洗。10. 滴加生物素化鼠抗地高辛：37℃60分鐘或20℃左右120分鐘。05M PBS洗5分鐘×4次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。11. 滴加SABC：37℃20分鐘或20℃左右30分鐘。0.5M PBS洗5分鐘×

58、3次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。12. 滴加生物素化過氧化物酶：37℃20或20℃左右30分鐘。0.5M PBS洗5分鐘×4次。13. DAB顯色: 使用DAB顯色試劑盒1ml蒸餾水加顯色劑A、B、C各一滴，混勻，加至標本上。一般顯色20-30分鐘。若無背景出現(xiàn)則可繼續(xù)顯色。也可自配DAB顯色劑后顯色。充分水洗。14. 必要時蘇木素更染，充分水洗。15. 酒精脫水，二甲苯透明，封片。,二、石蠟切片

59、如果有條件的話，應(yīng)盡可能地采用新鮮標本。標本離體后，及時予以固定。固定液為4％多聚甲醛/0.1M PBS（pH7.0-7.4），含有1/1000 DEPC。標本較大時用刀片切成厚度不超過4mm的小塊，固定2小時即可，較大的標本固定不要超過4小時。某些組織對過度固定大其敏感，如動物大腦，固定時間一定不要超過1小時。1. 常規(guī)脫水、浸蠟、包埋。切片厚度6-8μm。2. 玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。3. 石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟

60、至水。3%H2O2室溫處理10分鐘。蒸餾水洗滌2次。,4. 暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3％檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶（1ml 3％檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻），37℃消化10-60分鐘。用戶可以比較不同的消化時間，例如10分鐘，20分鐘，30分鐘和60分鐘，以找到最佳的消化時間。0.5M PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。其余步驟和冰凍切片6-15步相同。結(jié)果觀察：BCL-2 mRNA的細胞胞漿著色呈棕黃色。

61、注意事項：如果有少量的細胞核著色屬于正常情況；如果出現(xiàn)大量的細胞核著色，往往和標本固定時間過長有關(guān)，應(yīng)重新處理標本。有其它明顯的非特異性染色現(xiàn)象時，可以用預(yù)雜交液對含探針的雜交液進行稀釋，一般稀釋2-5倍。,P53 ISH 人結(jié)腸癌P53原位雜交染色，DAB顯色。,NM23 ISH 人前列腺nm23基因原位雜交染色，DAB顯色，癌細胞呈強陽性染色。,NMDA-2A ISH 大鼠標本谷氨酸受體NMDAR2A基因原位雜交染色，DBA顯色，神

62、經(jīng)元呈強陽性染色。,TIMP-2 ISH 大鼠病肝臟TIMP-2基因原位雜交染色，DAB顯色，病變肝細胞呈強弱不等的染色。,MCAS-Se,WiDr-Se,MCAS-H,WiDr-H,,,Protocol for In situ hybridization of cultured cells1. Put APES coating coverslips in dish for cell culture till cell confl

63、uent?2. Wash coverslips with PBS(-) for 5 min 1 times at R.T.?3. Fix by 4% Paraformadehyde/PBS for 15 min at R.T.?4. Wash by PBS(-) for 5 min? 3 at R.T.)?5. Wash by autoclaved MilliQ water 5 min?1 at R.T.?6

64、. Air dry by blower (dryer) in Clean Bench for 30 min?7. Dry in incubator for 3 hours or overnight at 45?C ?8. Store coverslips in RNase free slide case (treated with DEPC water and 70% EtOH), Sealed and store in

65、–80?C. (Store at -20?C for 1-2 months) or aluminum foil,?9. Return slide case to R.T.?10. Rinse in PBS for 5 min ×3?11. Rinse in 0.2N HCl for 20 min at R.T.,?12. Rinse in 0.2% Triton X-100/PBS and shake for

66、 10 min ?13. Digested by Proteinase K in TE buffer (1?g/ml) for 15-20 min at 37?C ? (300?l /slide)14. Fix with 4% paraformadehyde/0.1M PB for 5-10 min at R.T.?15. Rinse in 0.2% (2mg/ml) Glycine/0.1M PB for

67、15 min ×2 at R.T. ? (300?l /slide)16. Rinse in 40%formamide/ 4×SSC for 30 min at R.T.?17. Add hybridization solution containing H or Se RNA probe (10?l /200 -300?l) on slide and cover with coverslip

68、s in moist chamber (with 50% formamide and 2?SSC) (200 ?l/slide) overnight at 45-55?. (200 ?l/slide),?18. Remove the slides in 2?SSC-0.1%SDS?19. Wash with 2?SSC-0.1%SDS for 15 min?2 and shake at 45-55?C?20. Wash wit

69、h 0.2?SSC-0.1%SDS for 15 min?2 and shake at 45-55?C?21. Wash with Buffer A (0.1M Tris-HCl/0.15M NaCl, pH 7.5), shake for 10 min?2?22. Add Blocking Solution (1% Blocking reagent in Buffer A) for 30 min (200 ?l/slide

70、)?23. Remove the Blocking solution?24. Add 200 ?l solution of Anti-DIG complex in Blocking Solution on coverslips, then in moist chamber with 2?SSC for 30 min (or at 4?overnight) (1:1000-1:2000 diluted, 1.5?l/1.5ml),