核酸代謝課件

1、第9章 核酸代謝,① 作為合成核酸的原料：如ATP，GTP，CTP，UTP用于合成RNA，dATP，dGTP，dCTP，dTTP用于合成DNA。② 作為能量的利用形式：除ATP之外，還有GTP，UTP，CTP等。,核苷酸類(lèi)物質(zhì)在人體具有多方面的生理功用,③ 參與代謝或生理活動(dòng)調(diào)節(jié):cAMP和cGMP作為激素的第二信使。④ 參與構(gòu)成酶的輔酶或輔基：如在NAD+，NADP+，F(xiàn)AD，F(xiàn)MN，CoA中均含有核苷酸的成分。⑤ 作為代謝中

2、間物的載體：如用UDPG作為葡萄糖的供體，用CDP攜帶膽堿等。,核苷酸類(lèi)物質(zhì)在人體具有多方面的生理功用,核酸的消化與吸收,第1節(jié) 核酸的分解代謝,一、核苷酸的降解,核苷酸酶：,3’-核苷酸酶：只能水解3’-核苷酸 5’-核苷酸酶：只能水解5’-核苷酸,核苷酶：催化核苷分解為戊糖和堿基,嘌呤核苷酶 & 嘧啶核苷酶,核苷磷酸化酶：催化核苷分解生成含氮堿基和戊糖的磷酸酯，對(duì)兩種核苷都起作用,核苷水解酶：催化核苷分解生成

3、含氮基和戊糖，對(duì)脫氧核糖核苷不起作用,一、核苷酸的降解,一、核苷酸的降解,二、嘌呤的降解,靈長(zhǎng)類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)、某些爬行類(lèi)和昆蟲(chóng)：尿酸人類(lèi)及靈長(zhǎng)類(lèi)以外的哺乳動(dòng)物、腹足類(lèi)：尿囊素硬骨魚(yú):尿囊酸大多數(shù)魚(yú)類(lèi)、兩棲類(lèi)：尿素和乙醛酸甲殼類(lèi)、海洋無(wú)脊椎動(dòng)物體：氨和二氧化碳,不同生物嘌呤分解的代謝最終產(chǎn)物,嘌呤類(lèi)在核苷酸、核苷和堿基三個(gè)水平上的降解,三、嘧啶的降解,嘧啶分解代謝特點(diǎn):,1、還原降解，環(huán)被打破2、終產(chǎn)物： NH3 、CO2 、β

4、-丙氨酸、β-氨基異丁酸,嘧啶分解時(shí)，有氨基的首先水解脫氨基。,胞嘧啶脫氨基即轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，尿嘧啶和胸腺嘧啶經(jīng)還原打破環(huán)內(nèi)雙鍵后，水解開(kāi)環(huán)成鏈狀化合物，繼續(xù)水解成二氧化碳、氨、β-丙氨酸和β-氨基異丁酸，后者脫氨基后進(jìn)入有機(jī)酸代謝或直接排出體外。,三、嘧啶的降解,,第2節(jié) 核酸的合成代謝,一、核苷酸的生物合成,從頭合成途徑　不以現(xiàn)成的堿基為原料，而是利用磷酸核糖、氨基酸、一碳單位及CO2等簡(jiǎn)單物質(zhì)為原料，經(jīng)過(guò)一系列酶促反應(yīng)，合成核苷酸

5、的途徑。（肝細(xì)胞及多數(shù)細(xì)胞）補(bǔ)救合成途徑　利用體內(nèi)游離的堿基或核苷，經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的反應(yīng)過(guò)程，合成核苷酸的途徑。（腦組織和骨髓）,1、嘌呤核苷酸的生物合成,（1）“從頭合成”途徑,① 嘌呤堿的合成 主要以二氧化碳、甲酸鹽、甘氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺為原料合成嘌呤環(huán)。,嘌呤堿各原子的來(lái)源,嘌呤最初不是以游離堿基的形式合成，而是從5-磷酸核糖焦磷酸(PRPP) 開(kāi)始，經(jīng)一系列酶促反應(yīng)，先生成次黃嘌呤核苷酸（肌苷酸, IMP），然后再轉(zhuǎn)變

6、為AMP和GMP。合成部位：肝臟胞液,② 嘌呤核苷酸的合成,a.IMP的合成,磷酸核糖焦磷酸酰胺基轉(zhuǎn)移酶,IMP在腺苷酸琥珀酸合成酶的催化下，由天冬氨酸提供氨基合成腺苷酸琥珀酸，然后裂解產(chǎn)生腺苷酸和延胡索酸。IMP也可在IMP脫氫酶的催化下，以NAD+為受氫體，脫氫氧化為黃苷酸（XMP），后者再在鳥(niǎo)苷酸合成酶催化下，由谷氨酰胺提供氨基合成鳥(niǎo)苷酸。,b. AMP和GMP的生成,b. AMP和GMP的生成,嘌呤核苷酸從頭合成特點(diǎn),嘌呤核

7、苷酸是在磷酸核糖分子上逐步合成的。 先合成IMP，再轉(zhuǎn)變成AMP或GMP。 PRPP是5-磷酸核糖的活性供體。,（2）補(bǔ)救途徑,腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（APRT） 次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT) 腺苷激酶,參與補(bǔ)救合成的酶,補(bǔ)救合成過(guò)程,補(bǔ)救合成的生理意義,補(bǔ)救合成節(jié)省從頭合成時(shí)的能量和一些氨基酸的消耗。 彌補(bǔ)體內(nèi)某些組織器官，如腦、骨髓等不能進(jìn)行從頭合成核苷酸的不足。,（3）嘌呤核苷酸合成的調(diào)節(jié),PRPP合成酶

8、谷氨酰胺磷酸核糖酰胺轉(zhuǎn)移酶AMP,+,+,GTP,（3）嘌呤核苷酸合成的調(diào)節(jié),（4）嘌呤核苷酸合成的抗代謝物,嘌呤核苷酸的抗代謝物是一些嘌呤、氨基酸或葉酸等的類(lèi)似物。主要以競(jìng)爭(zhēng)性抑制干擾或阻斷嘌呤核苷酸的合成代謝，從而進(jìn)一步阻止核酸以及蛋白質(zhì)的生物合成。,（4）嘌呤核苷酸合成的抗代謝物,抗代謝物即代謝抑制物（劑），都是與代謝物在結(jié)構(gòu)上的類(lèi)似物。它們?cè)诖x反應(yīng)中跟正常的代謝物相拮抗，以減少正常代謝物參加反應(yīng)的機(jī)會(huì)，從而影響正常代謝。,

9、次黃嘌呤(H),6-巰基嘌呤(6-MP),嘌呤類(lèi)似物：主要有6-巰基嘌呤（6-MP）,,6-MP,,6-MP核苷酸,從頭合成途徑,補(bǔ)救合成途徑,,HGPRT,PRPP酰胺轉(zhuǎn)移酶,IMP,AMP 和 GMP,,,,,,6-MP 核苷酸是IMP的類(lèi)似物,2、嘧啶核苷酸的生物合成,（1）“從頭合成”途徑,① 嘧啶堿的合成 利用氨基酸、NH3和CO2等簡(jiǎn)單前體物逐步合成嘧啶核苷酸,嘧啶環(huán)中各原子的來(lái)源,② 嘧啶核苷酸的生物合成,特點(diǎn)：先

10、利用小分子化合物形成嘧啶環(huán)，再與磷酸核糖（PRPP提供）結(jié)合成乳清酸，然后生成尿苷酸(UMP)。其他嘧啶核苷酸由尿苷酸轉(zhuǎn)變而成。 合成部位：主要是肝細(xì)胞的胞液,a.乳清酸的生物合成,b.UTP和CTP的生物合成,（2）“補(bǔ)救”途徑,,,,-,（3）嘧啶核苷酸合成的調(diào)節(jié),,,二、脫氧核糖核苷酸的生物合成,DNA合成需要脫氧核苷三磷酸為原料，生物體中的脫氧核苷酸是由核糖核苷酸還原生成的，即在核糖核苷酸還原酶（RR）作用下，核糖核苷二磷酸（

11、NDP）核糖部分的2‘-羥基被氫原子取代，轉(zhuǎn)變成脫氧核糖核苷二磷酸（dNDP）。,1、二磷酸脫氧核糖核苷的生成,二、脫氧核糖核苷酸的生物合成,2、脫氧胸腺嘧啶核苷酸的合成,胸苷酸由脫氧尿苷酸甲基化生成,3、脫氧核苷酸的抗代謝物,① 5-氟尿嘧啶及阿糖胞苷、環(huán)胞苷等，在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的核苷一磷酸及核苷三磷酸，能與胸苷酸合成酶結(jié)合成不解離的復(fù)合物，從而抑制dTMP的合成，可以阻斷TMP合成。②氨蝶呤及甲氨蝶呤是葉酸的衍生物，能競(jìng)爭(zhēng)抑制二氫

12、葉酸還原酶，使葉酸不能還原成二氫葉酸及四氫葉酸。,5-氟尿嘧啶(5-FU) 是胸腺嘧啶的類(lèi)似物。,3、脫氧核苷酸的抗代謝物,4、核苷三磷酸的生物合成,嘌呤核苷酸合成小結(jié),,IMP,嘧啶核苷酸合成小結(jié),,,,,UMP,復(fù)制：是親代雙鏈DNA按堿基配對(duì)原則，準(zhǔn)確形成兩個(gè)相同核苷酸序列的子代DNA分子的過(guò)程。兩條DNA鏈都可作為復(fù)制的模板。,三、DNA的生物合成,1、DNA的半保留復(fù)制,DNA在復(fù)制時(shí)，兩條鏈分開(kāi)，在DNA聚合酶的催化下按堿基

13、配對(duì)方式按照單鏈DNA的核苷酸順序合成新鏈，以組成新的DNA分子。,這樣新形成的兩個(gè)子代DNA分子堿基序列與親代分子完全一樣。一條鏈來(lái)自親代的DNA鏈，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻模@種復(fù)制方式稱(chēng)為半保留復(fù)制。,DNA半保留復(fù)制實(shí)驗(yàn),含N15-DNA的細(xì)菌,第一代,第二代,梯度離心結(jié)果,實(shí)驗(yàn)證據(jù): 1957年Meselson和Stahl用同位素15N標(biāo)記大腸桿菌DNA，首先證明了DNA的半保留復(fù)制。,按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿

14、基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的相對(duì)穩(wěn)定性。遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但不是絕對(duì)的。,半保留復(fù)制的意義,（1）大腸桿菌DNA聚合酶：將脫氧核苷酸連接成DNA,2、DNA復(fù)制酶,DNA聚合酶I催化DNA新鏈合成時(shí)需要： 4種dNTP底物：(dATP、dGTP、dCTP、dTTP) 、Mg2+ DNA模板: 解開(kāi)成單鏈的DNA母鏈 引物：與模板DNA互補(bǔ)的一小段多核苷酸,其上帶有能與核苷酸相結(jié)合的

15、游離3′-OH 合成的方向：5′→3′,復(fù)制的基本化學(xué)反應(yīng)是核苷酸之間生成：3′,5′-磷酸二酯鍵,(dNMP)n + dNTP → (dNMP)n+1 + PPi,DNA聚合酶I的性質(zhì) 分子量：103000，單鏈，球形，活性部位含Zn2+，電鏡下可以看到二聚體，每個(gè)細(xì)胞有400個(gè)酶分子。,1955年Kornberg等首先從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶Ⅰ（polⅠ），其后在廣泛不同的生物中找到有這種酶。,① polⅠ,① 5′

16、→3′聚合酶活性；② 3′→5′外切酶活性；③ 5′→3′外切酶活性；④ 主要功能是對(duì)DNA損傷的修復(fù)以及在DNA復(fù)制時(shí)，RNA引物切除后，填補(bǔ)其留下的空隙。,DNA聚合酶I功能,,,,,3? ? 5?外切酶活性,,,5? ? 3?外切酶活性,?,能切除引物和突變的 DNA片段。,能辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對(duì)，并將其水解。,核酸外切酶活性,5′→3′的聚合酶活性 3′→5′外切酶活性 只是在無(wú)polⅠ及polⅢ的情況下暫時(shí)起作用。

17、對(duì)模板的特異性不高, 可能在DNA損傷修復(fù)中起作用,② pol II,是復(fù)制延長(zhǎng)中真正起催化作用的酶。由10種亞基組成不對(duì)稱(chēng)的二聚體，每個(gè)單體都具有催化活性，一個(gè)作用于前導(dǎo)鏈，一個(gè)作用于隨從鏈。使DNA兩股鏈在同一位置同一時(shí)間進(jìn)行合成。,③ pol Ⅲ,包括DNA聚合酶α、β、γ、δ、ε DNA聚合酶α和δ：復(fù)制染色體DNA。 DNA聚合酶α負(fù)責(zé)隨從鏈的合成。 DNA聚合酶δ催化領(lǐng)頭鏈的合成，還具有3‘→5’外切酶活性。,（2

18、）真核細(xì)胞的DNA聚合酶,催化DNA聚合,參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù),校對(duì)、修復(fù)合成、切除引物填補(bǔ)空隙,功能,20,40,400,分子數(shù)/細(xì)胞,10,1,1,亞基數(shù),－,－,+,5?? ??外切酶活性,+,+,+,??? 5?外切酶活性,+,+,+,5?? ??聚合酶活性,pol III,pol II,pol I,,,,,E. Coli中的DNA聚合酶,（3）DNA連接酶,——催化雙鏈DNA中的切口處的相鄰5‘-磷酸基與3’-羥基之間

19、形成磷酸酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈?！荒軐蓷l游離的DNA單鏈連接起來(lái)。,DNA連接酶：若雙鏈DNA中一條鏈有切口, 一端是3′-OH, 另一端是5′-磷酸基,連接酶可催化這兩端形成磷酸二酯鍵，而使切口連接。,在復(fù)制中起接合雙鏈中單鏈缺口的作用。 在DNA復(fù)制、修復(fù)、重組中均起重要作用。 是基因工程的重要工具酶之一。,DNA連接酶的功能,（4）拓?fù)洚悩?gòu)酶,DNA復(fù)制時(shí)雙鏈DNA解開(kāi)為單鏈，DNA分子繞雙螺

20、旋軸反向旋轉(zhuǎn)。 復(fù)制速度快，旋轉(zhuǎn)的速度也很快，將達(dá)100次/秒，造成DNA分子的打結(jié)、纏繞現(xiàn)象發(fā)生。 需要DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用，來(lái)理順DNA雙鏈，以配合復(fù)制過(guò)程。,解鏈過(guò)程中，DNA分子會(huì)過(guò)度擰緊、打結(jié)、纏繞、連環(huán)等現(xiàn)象。,（4）拓?fù)洚悩?gòu)酶,拓?fù)洚悩?gòu)酶作用特點(diǎn)既能水解 、又能連接磷酸二酯鍵克服解鏈過(guò)程中的打結(jié)、纏繞現(xiàn)象,拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ 拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ,分 類(lèi),（4）拓?fù)洚悩?gòu)酶,拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ,切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋

21、轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時(shí)候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應(yīng)不需ATP。,拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ,切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過(guò)切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。利用ATP供能，連接斷端， DNA分子進(jìn)入負(fù)超螺旋狀態(tài)。（主要）,作用機(jī)制,拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的作用,拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的作用,（5）解螺旋酶,解螺旋酶又稱(chēng)解鏈酶或rep蛋白利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開(kāi)成為兩條單鏈。每解開(kāi)一對(duì)堿基，需消耗2分子ATP。,3、DNA的復(fù)制過(guò)程,（1）復(fù)制的起始,

22、需要解決兩個(gè)問(wèn)題：,a. DNA解開(kāi)成單鏈，提供模板。,b. 合成引物，提供3?-OH末端；形成引發(fā)體。,①?gòu)?fù)制的起始點(diǎn),DNA復(fù)制開(kāi)始于染色體上的特定部位，稱(chēng)為起始點(diǎn)，用oricC表示。 在DNA的復(fù)制原點(diǎn)，雙股螺旋解開(kāi)，成單鏈狀態(tài)，分別作為模板，各自合成其互補(bǔ)鏈。 在起點(diǎn)處形成一個(gè)“眼”狀結(jié)構(gòu)，在的兩端出現(xiàn)兩個(gè)叉子狀的生長(zhǎng)點(diǎn)，稱(chēng)為復(fù)制叉。 在復(fù)制叉上結(jié)合各種與復(fù)制有關(guān)的酶和輔助因子，并在DNA鏈上構(gòu)成與核糖體相似大小的復(fù)合體稱(chēng)

23、為復(fù)制體。,② 復(fù)制的方向,復(fù)制的方向有三種不同的機(jī)制： 從兩個(gè)起始點(diǎn)開(kāi)始，各以相反的單一方向生長(zhǎng)出一條新鏈，形成兩個(gè)復(fù)制叉； 從一個(gè)起始點(diǎn)開(kāi)始，以同一方向生長(zhǎng)出兩條鏈，形成一個(gè)復(fù)制叉； 從一個(gè)起始點(diǎn)開(kāi)始，沿兩個(gè)相反的方向各生長(zhǎng)出兩條鏈，形成兩個(gè)復(fù)制叉——雙向復(fù)制。,② 復(fù)制的方向,復(fù)制起始點(diǎn)、復(fù)制子與復(fù)制叉,③ RNA引物的合成,DNA聚合酶都需要一個(gè)具有3‘-OH的引物才能將合成原料dNTP一個(gè)一個(gè)接上去，RNA引物酶（引物合

24、成酶，引發(fā)酶）可以DNA為模板合成一段RNA，做為合成DNA的引物。,領(lǐng)頭鏈,隨從鏈,（2）復(fù)制的延長(zhǎng)：復(fù)制的半不連續(xù)性,1968年日本生化學(xué)者岡崎用電鏡及放射自顯影技術(shù)，觀察到DNA復(fù)制中出現(xiàn)一些不連續(xù)的片段，將這些不連續(xù)的片段稱(chēng)為岡崎片段。 原核生物: 1000～2000個(gè)核苷酸。 真核生物: 100～200個(gè)核苷酸。,岡崎片段,復(fù)制過(guò)程簡(jiǎn)圖,順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的這股鏈稱(chēng)為領(lǐng)頭鏈或前導(dǎo)鏈。 另一股鏈因

25、為復(fù)制的方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長(zhǎng)，這股不連續(xù)復(fù)制的鏈稱(chēng)為隨從鏈或后隨連。 領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制而隨從鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)制的半不連續(xù)性。,領(lǐng)頭鏈的合成,,隨從鏈的合成,半不連續(xù)復(fù)制動(dòng)畫(huà),（3）復(fù)制的終止,在DNA延長(zhǎng)階段結(jié)束后，原核生物的RNA引物被DNA聚合酶Ⅰ切除，留下的空隙由DNA聚合酶Ⅰ進(jìn)行補(bǔ)滿(mǎn)，即從另一岡崎片段的3’-OH按5‘→3’根據(jù)堿基配對(duì)原則，將一個(gè)個(gè)的dNTP補(bǔ)上去，最后的缺口再由DNA連接酶將相鄰的

26、兩個(gè)核苷酸借磷酸二酯鍵連起來(lái)，即成完整的一條新鏈。,4、RNA指導(dǎo)的DNA合成,以RNA為模板，按照RNA中的核苷酸順序合成DNA，與通常轉(zhuǎn)錄過(guò)程中遺傳信息從DNA到RNA的方向相反，稱(chēng)為逆轉(zhuǎn)錄。 逆轉(zhuǎn)錄酶(RNA依賴(lài)的DNA聚合酶)以RNA為模板在四種dNTP存在及合適條件下，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則合成互補(bǔ)DNA（cDNA）。,逆轉(zhuǎn)錄酶,從RNA病毒中發(fā)現(xiàn)，能催化以RNA為模板合成雙鏈DNA的酶，全稱(chēng)為依賴(lài)RNA的DNA聚合酶?；?/p>

27、性：RNA指導(dǎo)的DNA聚合活性 RNase H活性　　　 DNA指導(dǎo)的DNA聚合活性,四、DNA的損傷與修復(fù),突變：DNA的核苷酸序列永久的改變稱(chēng)為突變，從分子水平來(lái)看，突變就是DNA分子上堿基的改變。 進(jìn)化：突變有利于生物的生存則保留下來(lái)。 淘汰：突變不適應(yīng)于自然選擇。,1、DNA損傷的類(lèi)型,DNA損傷：泛指一切DNA結(jié)構(gòu)和功能的變化。包括各種突變類(lèi)型、堿基的損傷和DNA鏈的斷裂。 突變：是由

28、遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變而引起的遺傳信息的改變。從分子水平來(lái)看，突變就是DNA分子上堿基的改變。,（1）點(diǎn)突變： ——DNA分子上一個(gè)堿基的變異，常見(jiàn)的是堿基對(duì)的置換。,轉(zhuǎn)換：發(fā)生在同型堿基之間，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。 顛換：發(fā)生在異型堿基之間，即嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤。,1、DNA損傷的類(lèi)型,鐮形紅細(xì)胞貧血病人Hb (HbS) β亞基,正常成人Hb (HbA)β亞基,（1）點(diǎn)突變,1949年波林發(fā)現(xiàn)鐮刀型細(xì)胞貧血癥（病

29、人的紅血細(xì)胞為鐮刀形）與血紅蛋白結(jié)構(gòu)異常相關(guān)。,（1）點(diǎn)突變,缺失引起移碼突變,缺失是指一個(gè)堿基或一段核苷酸鏈乃至整個(gè)基因從DNA大分子上丟失。,（2）缺失,（3）插入：原來(lái)沒(méi)有的堿基或是一段原來(lái)沒(méi)有的核 苷酸序列插入到DNA大分子中去。或有 些芳香族分子如吖啶嵌入DNA雙螺旋堿

30、 基對(duì)中，引起移碼突變，影響三聯(lián)體密 碼的閱讀方式。,（4）倒位：DNA鏈內(nèi)部重組，使其一段方向顛倒 。,2、造成DNA損傷的因素,自發(fā)性:自然錯(cuò)配率約為10-9～10-10 左右。物理因素:如UV、各種輻射?；瘜W(xué)因素:烷化劑、堿基類(lèi)似物、以及其他一些人工合成或環(huán)境中存在的化學(xué)物質(zhì)，這些誘發(fā)突變的化學(xué)物質(zhì)，稱(chēng)為致癌劑。生物因素: 抗菌素類(lèi)、黃曲霉素和病毒等。,修復(fù)：是對(duì)已發(fā)生分子

31、改變的補(bǔ)償措施，使其回復(fù)為原有的天然狀態(tài)。,3、修復(fù)機(jī)制,,光修復(fù)酶,（1）光修復(fù),,,,（2）切除修復(fù),,,,UvrA,UvrB,,UvrC,,,,,,,OH,P,,DNA聚合酶Ⅰ,,,,OH,P,,,,DNA連接酶,NAD+,E.coli的切除修復(fù)機(jī)制,是細(xì)胞內(nèi)最重要和有效的修復(fù)機(jī)制，主要有特異的核酸內(nèi)切酶、外切酶、聚合酶和連接酶。,,（3）重組修復(fù)（復(fù)制后的修復(fù)）,,（4）誘導(dǎo)修復(fù),能造成DNA損傷或抑制復(fù)制的處理能引起一系列復(fù)雜

32、的誘導(dǎo)效應(yīng)，稱(chēng)為應(yīng)急反應(yīng)（SOS）。包括誘導(dǎo)出現(xiàn)的DNA損傷修復(fù)效應(yīng)、誘變效應(yīng)、細(xì)胞分裂的抑制及溶源性細(xì)菌釋放噬菌體。,五、重組DNA技術(shù),DNA重組是指在兩個(gè)DNA分子之間，或一個(gè)DNA分子的兩個(gè)不同部位之間通過(guò)鏈斷裂和片段的交換重接，改變了基因的組合序列，這種交換可發(fā)生在同一細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間，甚至不同物種的DNA； DNA重組存在于真核細(xì)胞、原核細(xì)胞、病毒和質(zhì)粒中。,1、重組DNA分子的構(gòu)建,（1）目的基因的獲得,載體DNA和所需

33、要的外源目的基因在體外提取mRNA在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下合成單股互補(bǔ)Cdna人工合成的DNA片段,（2）載體：質(zhì)?？勺鳛檩d體在真核細(xì)胞中生活及表達(dá)，是細(xì)菌染色體外小的雙鏈閉環(huán)的DAN分子，能自主復(fù)制，并含有抗藥性基因。,（3）工具酶：限制性?xún)?nèi)切酶、DNA連接酶、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、S1核酸酶（切單鏈DNA或RNA）、堿性磷酸酶等。,1、重組DNA分子的構(gòu)建,2、引入宿主細(xì)胞,任何外源DNA重組到載體上，然后轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中復(fù)制繁

34、殖的過(guò)程為DNA的克隆，也稱(chēng)為轉(zhuǎn)化。 宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞。,挑選含有重組DNA分子的細(xì)胞，使之克隆化并加以鑒定，可大量擴(kuò)增或表達(dá)。,3、篩選,基因工程的操作過(guò)程,六、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),PCR是一種在體外快速擴(kuò)增特點(diǎn)基因或DNA序列的方法，又稱(chēng)為基因的體外擴(kuò)增法。,1. 變性：加熱使模板DNA雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈2. 退火 ：突然降溫后模板DNA與引物按堿基配對(duì)原則互補(bǔ)結(jié)合，也存在兩條模板鏈之間的結(jié)合，但由于引物的高

35、濃度，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，主要的結(jié)合發(fā)生在模板與引物之間。,六、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),3. 延伸：將反應(yīng)溫度調(diào)節(jié)到酶的最適溫度，在DNA聚合酶、4種 dNTPs 及鎂離子等存在的條件下，以引物的 3′ 端開(kāi)始，結(jié)合單核苷酸，形成與模板鏈互補(bǔ)的新DNA鏈。 上述 3 步為一個(gè)循環(huán)，每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，樣本中的DNA量應(yīng)該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過(guò)25～40個(gè)循環(huán)后DNA可擴(kuò)增106 ～ 109 倍。,六、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),,

36、,,,,,,,,,,,,,,,,,PCR 動(dòng)畫(huà),1st cycle,2nd cycle,3rd cycle,過(guò) 程,,變 性,引 物 退 火,DNA 復(fù)制,,,七、 RNA的生物合成,1、DNA指導(dǎo)下RNA的合成——轉(zhuǎn)錄,以DNA的一條鏈為模板，在RNA聚合酶催化下，以四種核糖核苷磷酸為底物，按照堿基配對(duì)原則，形成3′,5′-磷酸二酯鍵，合成一條與DNA鏈的一定區(qū)段互補(bǔ)的RNA鏈的過(guò)程稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄。,相同點(diǎn)：1.都以D

37、NA為模板 2.原料為核苷酸 3.合成方向均為5′→3′方向 4.都需要依賴(lài)DNA的聚合酶 5.遵守堿基互補(bǔ)配對(duì)規(guī)律 6.產(chǎn)物為多聚核苷酸鏈,轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的異同,不同點(diǎn)： 復(fù)制 轉(zhuǎn)錄 模板 兩股鏈均作為模板 模板鏈作為模板 原料 dNTP N

38、TP 聚合酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶 產(chǎn)物 子代DNA雙鏈 mRNA;tRNA;rRNA 配對(duì) A-T；G-C A-U；T-A；G-C 引物 需RNA引物 不需要引物 方式(特點(diǎn)) 半保留復(fù)制 不對(duì)稱(chēng)轉(zhuǎn)錄,轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的異同,DNA分子中能轉(zhuǎn)錄出mR

39、NA然后指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的部分稱(chēng)為結(jié)構(gòu)基因。其余的DNA可能轉(zhuǎn)錄(rRNA,tRNA), 也可能不轉(zhuǎn)錄。結(jié)構(gòu)基因的雙鏈中，只有一股鏈可作為模板轉(zhuǎn)錄成RNA，稱(chēng)為模板鏈（負(fù)鏈、反意義鏈）。,與模板相對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)鏈，編碼區(qū)的堿基序列與mRNA的密碼序列相同，稱(chēng)為編碼鏈（正鏈、有意義鏈）。不對(duì)稱(chēng)轉(zhuǎn)錄:不同基因的模板鏈與編碼鏈在DNA分子上并不是固定在某一股鏈的現(xiàn)象。,反意義鏈或負(fù)鏈,有意義鏈或正鏈,轉(zhuǎn)錄是依賴(lài)DNA的RNA聚合酶，也稱(chēng)為DNA

40、指導(dǎo)的RNA聚合酶，簡(jiǎn)稱(chēng)為RNA聚合酶。 ①σ因子：識(shí)別并結(jié)合啟動(dòng)子的亞基，辨認(rèn)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，但不能單獨(dú)與DNA模板結(jié)合； ②原核生物的RNA聚合酶 （大腸桿菌RNA聚合酶 ）分子量為450kDa，由四個(gè)亞基組成α2ββ′σ(全酶)去掉σ亞基稱(chēng)為核心酶,（1）參與轉(zhuǎn)錄的酶,大腸桿菌RNA聚合酶,核心酶,全酶,啟動(dòng)子：被RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的模板DNA的部位，稱(chēng)為啟動(dòng)子。,終止子在一個(gè)基因的末端往往有一段特定

41、順序，它具有轉(zhuǎn)錄終止的功能，這段終止信號(hào)的順序稱(chēng)為終止子。,③真核生物的RNA聚合酶,RNA聚合酶Ⅰ：存在核仁中，主要催化rRNA前體的轉(zhuǎn)錄 RNA聚合酶Ⅱ：存在于核質(zhì)中，催化mRNA前體的轉(zhuǎn)錄 RNA聚合酶Ⅲ：存在于核質(zhì)中，催化小分子量RNA的轉(zhuǎn)錄,（2）RNA的轉(zhuǎn)錄過(guò)程,RNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程,起始延伸終止,,在σ亞基作用下幫助全酶找到啟動(dòng)子，并與啟動(dòng)子結(jié)合生成較松弛的封閉型啟動(dòng)子復(fù)合物，識(shí)別部位大約在啟動(dòng)子的-35位點(diǎn)處； D

42、NA構(gòu)象改變活化，得到開(kāi)放型的啟動(dòng)子復(fù)合物，在10位點(diǎn)處解開(kāi)雙鏈，識(shí)別其中的模板鏈； 在起始位點(diǎn)的全酶結(jié)合第一個(gè)核苷三磷酸，第一個(gè)磷酸二酯鍵形成后, σ亞基即被釋放脫離核心酶。,① 起 始,② 延 伸,DNA分子和酶分子構(gòu)象改變，核心酶與DNA的結(jié)合松弛，沿模板移動(dòng)，并按模板序列選擇下一個(gè)核苷酸，將核苷三磷酸加到生長(zhǎng)的RNA鏈的3’-OH端，催化形成磷酸二酯鍵。 轉(zhuǎn)錄延伸的方向是沿DNA模板鏈的3‘→5’方向按堿基配對(duì)原則生成5‘→

43、3’的RNA產(chǎn)物。 當(dāng)新生的RNA鏈離開(kāi)模板DNA后，兩條DNA鏈則重新形成雙股螺旋結(jié)構(gòu)。,③ 終 止,在DNA分子上有終止轉(zhuǎn)錄的特殊堿基順序稱(chēng)為終止子，它具有使RNA聚合酶停止合成RNA和釋放RNA鏈的作用。 原核生物轉(zhuǎn)錄的終止有兩種機(jī)制：依賴(lài)ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止(ρ因子能與轉(zhuǎn)錄中的RNA結(jié)合) 不依賴(lài)ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止,（3）轉(zhuǎn)錄后加工,在轉(zhuǎn)錄中新合成的RNA是較大的前體分子，需要經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的加工修飾，才轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂猩飳W(xué)活性的、

44、成熟的RNA分子，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄后的加工，主要包括剪接、剪切和化學(xué)修飾。,內(nèi)含子：不連續(xù)基因中的插入序列，外顯子：被內(nèi)含子隔開(kāi)的基因序列，一個(gè)基因的外顯子和內(nèi)含子都轉(zhuǎn)錄在一條很大的原初轉(zhuǎn)錄本RNA分子中，故稱(chēng)為核內(nèi)不均一RNA（hnRNA），,真核生物細(xì)胞質(zhì)中的mRNA有三個(gè)結(jié)構(gòu)特點(diǎn),hnRNA被剪接，除去由內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄來(lái)的序列，將外顯子的轉(zhuǎn)錄序列連接起來(lái)在3‘末端連接上一段有20-30個(gè)腺苷酸的多聚腺苷酸（polyA）的“尾巴”

45、結(jié)構(gòu)，不同mRNA的長(zhǎng)度有很大的差異在5’末端接上一個(gè)“帽子”結(jié)構(gòu)m7GppmNP在內(nèi)部少數(shù)腺苷酸的腺嘌呤6位氨基發(fā)生甲基化（m6A）,真核細(xì)胞mRNA的加工,,② tRNA的加工,前tRNA3‘端的U由CCA取代嘌呤堿或核糖C2的甲基化尿苷被還原成雙氫尿苷（DH）或核苷內(nèi)的轉(zhuǎn)位反應(yīng)，成為假尿嘧啶核苷（Tψ）某些腺苷酸脫氨稱(chēng)為次黃嘌呤核苷酸,③rRNA的加工,原核生物rRNA的加工 原核生物的 16S 、23S和5S的

46、rRNA是從相對(duì)分子質(zhì)量約為200萬(wàn)的30S rRNA前體產(chǎn)生的。,真核生物rRNA的加工 一個(gè)大45S rRNA前體經(jīng)過(guò)一系列步驟生成5.8S、18S 和 28S rRNA,原核生物中rRNA前體的加工,真核生物中rRNA前體的加工,（4）轉(zhuǎn)錄的抑制作用,① 作用于RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄抑制劑 利福平或利福霉素能與原核細(xì)胞RNA聚合酶的β亞基非共價(jià)結(jié)合，阻止RNA轉(zhuǎn)錄的起始，對(duì)真核生物RNA聚合酶無(wú)作用； α-鵝膏蕈堿

47、是真核細(xì)胞中RNA合成的專(zhuān)一抑制劑，主要通過(guò)RNA聚合酶Ⅱ阻斷真核生物細(xì)胞核的mRNA合成。,② 作用于模板DNA的轉(zhuǎn)錄抑制劑 放線菌素D，插入DNA的dG-dC間，與G形成氫鍵，使DNA變形、失去模板功能，從而阻止RNA聚合酶沿模板鏈移動(dòng)而抑制RNA延長(zhǎng)。高濃度是可抑制RNA轉(zhuǎn)錄的起始，也抑制DNA復(fù)制。為原核和真核生物RNA聚合酶的專(zhuān)一抑制劑。,（4）轉(zhuǎn)錄的抑制作用,2、RNA指導(dǎo)下的RNA的合成——RNA復(fù)制,某些大腸桿菌

48、噬菌體是RNA病毒，這些RNA病毒是以RNA做模板復(fù)制出病毒RNA分子，RNA復(fù)制酶不存在于正常的大腸桿菌細(xì)胞中,感染時(shí)才由宿主產(chǎn)生。,從 Qβ噬菌體感染的大腸桿菌細(xì)胞中提出的RNA復(fù)制酶用四種核苷三磷酸為底物,催化合成與病毒RNA堿基序列互補(bǔ)的RNA鏈,和DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶所催化的反應(yīng)類(lèi)似。,復(fù)制酶的特異性非常高，它只識(shí)別病毒自身的RNA ，而對(duì)宿主細(xì)胞和其它與病毒無(wú)關(guān) 的RNA均無(wú)反應(yīng)。即Qβ的復(fù)制酶只能以噬菌體Qβ RNA作

49、模板，其它的都不行。,Qβ噬菌體RNA的復(fù)制,RNA病毒的繁殖方式,反轉(zhuǎn)錄病毒的RNA合成： RNA→DNA→RNA以病毒RNA為模板的RNA合成： RNA→RNA 在依賴(lài)于RNA的RNA聚合酶（RNA復(fù)制酶）催化下完成。,3、無(wú)模板的RNA合成（多核苷酸磷酸化酶）,多核苷酸磷酸化酶能使核苷二磷酸的混合物或一種核苷二磷酸聚合成類(lèi)似RNA的聚合物，反應(yīng)中釋放無(wú)機(jī)磷酸。,酶特點(diǎn)： 1

50、）只在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)； 2）是與RNA合成有關(guān)的酶， 3）以一種NDP或4種NDP為底物； 4）在細(xì)胞內(nèi)的功能可能是分解RNA。,甘油+ATP→α-磷酸甘油+ADPα-磷酸甘油+NAD+→磷酸二羥丙酮+NADH+H+磷酸二羥丙酮→3-磷酸甘油醛3-磷酸甘油醛+NAD+→1,3-二磷酸甘油酸+NADH+H+1,3-二磷酸甘油酸+ADP→2-磷酸甘油酸+ATP2-磷酸甘油酸→PEPPEP+A