第七章核酸及核酸代謝

1、第七章 核酸的生物化學(xué),Chapter 7 Biochemistry of Nucleic Acid,第一節(jié) 核酸的結(jié)構(gòu)與功能,Section 1 Structure and Function of Nucleic Acid,What’s nucleic acid?,核酸的發(fā)現(xiàn)：1869年瑞士米歇爾核酸的定義：生物體內(nèi)一類含有磷酸基團(tuán)的重要生物大分子（酸性物質(zhì)），是遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)，是遺傳信息的載體，在蛋白質(zhì)的生物合成中

2、起重要的作用。,核糖核酸(ribonucleic acid, RNA) RNA主要參與遺傳信息的表達(dá);脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA) DNA是遺傳信息的載體;,核酸的分類：,RNA和DNA都是以單核苷酸(nucleotide)為基本單位所組成的多核苷酸長(zhǎng)鏈。,1.1 The Chemical Component and Primary Structure of Nucleic Aci

3、d,1.1 核酸的化學(xué)組成及一級(jí)結(jié)構(gòu),核酸的水解產(chǎn)物：,1. 嘧啶堿(pyrimidine)：,一、核苷酸中的堿基組成,2. 嘌呤堿(purine)：,二、戊糖與核苷,1．戊糖(pentose)：,2．核苷(nucleoside)：,核苷是由戊糖與含氮堿基經(jīng)脫水縮合而生成的化合物。在大多數(shù)情況下，核苷是由核糖或脫氧核糖的C1′?-羥基與嘧啶堿N1或嘌呤堿N9進(jìn)行縮合，故生成的化學(xué)鍵稱為?，N糖苷鍵。,,,堿基和核糖的縮合物，以N-糖苷

4、鍵相連；成苷位置： 核糖C-1?與嘧啶N-1； 核糖C-1?與嘌呤N-9。核苷： 腺苷A，鳥(niǎo)苷G，胞苷C，尿苷U；脫氧核苷： 脫氧腺苷dA,脫氧鳥(niǎo)苷dG,脫氧胞苷dC,脫氧胸苷dT；,2．核苷(nucleoside)：,“稀有核苷”是由“稀有堿基”所生成的核苷。,三、核苷酸的結(jié)構(gòu)與命名,核苷酸(nucleotide)是由核苷與磷酸經(jīng)脫水縮合后生成的磷酸酯類化合物，包括:核糖核苷酸: 5?-AMP,

5、5?-GMP,5?-CMP,5?-UMP脫氧核糖核苷酸: 5?-dAMP,5?-dGMP,5?-dCMP,5?-dTMP與磷酸基縮合的位置：2?-核苷酸、3?-核苷酸和5?-核苷酸。最常見(jiàn)的核苷酸是5?-核苷酸（5?常被省略）,5 ?-核苷酸的分子結(jié)構(gòu),5?-核苷酸又可按其在5?位縮合的磷酸基的多少，分為一磷酸核苷（核苷酸）、二磷酸核苷和三磷酸核苷。,環(huán)核苷酸的分子結(jié)構(gòu),環(huán)一磷酸腺苷

6、 環(huán)一磷酸鳥(niǎo)苷,核苷酸的命名及縮寫(xiě)符號(hào),細(xì)胞內(nèi)游離核苷酸及其衍生物,1、含高能磷酸鍵的ATP類化合物；ATP是能量的直接供體；（脫氧）核苷三磷酸是合成RNA和DNA的原料； ATP、GTP、CTP、TTP、UTP； ADP、GDP、CDP、TDP、UDP；參加合成代謝； UTP--糖類合成、GTP--蛋白質(zhì)合成、CTP--脂類合成2、環(huán)狀核苷酸（cAMP、cGMP）第二信使，影響多種酶的活

7、性,四、核苷酸的性質(zhì),一般物理性質(zhì) ；互變異構(gòu)現(xiàn)象；紫外吸收，260nm ；核苷酸的兩性解離和等電點(diǎn) ；,互變異構(gòu)現(xiàn)象,uracil 酮式,uracil 烯醇式,堿基的紫外吸收,最大吸收峰在260nm附近,胞嘧啶核苷酸的解離,,,核苷酸的兩性解離和等電點(diǎn),4種核苷酸的解離曲線,可在pH2.0～5.0之間分離各種核苷酸,pH3.5時(shí)各核苷酸所帶電荷,（四）細(xì)胞內(nèi)游離核苷酸及其衍生物,1、含高能磷酸鍵的ATP類化合物；ATP是能

8、量的直接供體；（脫氧）核苷三磷酸是合成RNA和DNA的原料；ATP、GTP、CTP、TTP、UTP；ADP、GDP、CDP、TDP、UDP；參加合成代謝；UTP--糖類合成、GTP--蛋白質(zhì)合成、CTP--脂類合成2、環(huán)狀核苷酸（cAMP、cGMP）,五、核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu),一分子核苷酸的3?-位羥基與另一分子核苷酸的5?-位磷酸基通過(guò)脫水可形成3?,5?-磷酸二酯鍵，從而將兩分子核苷酸連接起來(lái)。,3',5'-磷

9、酸二酯鍵的形成,多核苷酸鏈,核酸就是由許多核苷酸單位通過(guò)3?,5?-磷酸二酯鍵連接起來(lái)形成的不含側(cè)鏈的長(zhǎng)鏈狀化合物。核酸是的方向性： 多核苷酸鏈的兩端，一端稱為5?-端，另一端稱為3?-端。,多核苷酸鏈簡(jiǎn)寫(xiě)方法,書(shū)寫(xiě)方向規(guī)定為： 5?-端→3?-端。,DNA分子：由dAMP、dGMP、dCMP和dTMP組成。 DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)就是指DNA分子中脫氧核糖核苷酸的排列順序及連接方式(3?,5?-磷酸二酯鍵)。RNA分子：

10、由AMP，GMP，CMP，UMP組成。 RNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)就是指RNA分子中核糖核苷酸的排列順序及連接方式。,核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu),DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)： 5?-AGTCCATG-3? AGTCCATG 3?-TCAGGTAC-5?RNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)： 5?-AGUCCAUG-3?

11、 AGUCCAUG,核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的表示方法,水解方式：酶法、堿法和酸法（1）堿水解 RNA?2?-核苷酸 + 3?-核苷酸 DNA ?DNA變性但不被水解（2）酸水解 DNA ?無(wú)嘌呤的DNA分子 （pH4） DNA（RNA）?堿基+戊糖+磷酸（強(qiáng)酸高溫）,核酸的水解作用,（3）核酸酶的水解作用核酸酶---水解核酸磷酸二酯鍵的酶種類根據(jù)底物不同分三

12、類： 脫氧核糖核酸酶（DNase） 核糖核酸酶（RNase） 核酸酶（Nuclease）根據(jù)核酸酶對(duì)底物作用特點(diǎn)分 核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶,核酸的水解作用,1.2 DNA的空間結(jié)構(gòu)與功能,1.2 Dimensional Structure and Function of DNA,一、DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)——雙螺旋結(jié)構(gòu)模型,DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)是DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的一種重要形式，它是Watson和

13、Crick兩位科學(xué)家于1953年提出來(lái)的一種結(jié)構(gòu)模型（獲1962年度諾貝爾獎(jiǎng)）。,James Watson (L) and Francis Crick (R), and the model they built of the structure of DNA,（一）對(duì)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型作出貢獻(xiàn)的科學(xué)家,1. Oswald Avery (1877-1955)Microbiologist Avery led the team that

14、showed that DNA is the unit of inheritance. One Nobel laureate has called the discovery "the historical platform of modern DNA research", and his work inspired Watson and Crick to seek DNA's structure.

15、 —— Nature, 2003,2. Erwin Chargaff (1905-2002) Chargaff discovered the pairing rules of DNA letters, noticing that A matches to T and C to G. He later criticized molecular biology, the discipline he helped

16、 invent, as "the practice of biochemistry without a licence", and once described Francis Crick as looking like "a faded racing tout". —— Nature, 2003,Chargaff 研究小組的貢獻(xiàn),1950～1953，C

17、hargaff研究小組對(duì)DNA的化學(xué)組成進(jìn)行了分析研究，發(fā)現(xiàn)：① DNA堿基組成有物種差異，且物種親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，差異越大；② 相同物種，不同組織器官中DNA堿基組成相同，而且不因年齡、環(huán)境及營(yíng)養(yǎng)而改變；③ DNA分子中四種堿基的摩爾百分比具有一定的規(guī)律性，即A=T、G=C、A+G=T+C。這一規(guī)律被稱為Chargaff規(guī)則。,3. Linus Pauling (1901-1994) The titan of twentieth-

18、century chemistry. Pauling led the way in working out the structure of big biological molecules, and Watson and Crick saw him as their main competitor. In early 1953, working without the benefit of X-ray pictures, he pub

19、lished a paper suggesting that DNA was a triple helix. —— Nature, 2003,4. Rosalind Franklin (1920-1958) Franklin, trained as a chemist, was expert in deducing the structure of molecules by firing

20、 X-rays through them. Her images of DNA - disclosed without her knowledge - put Watson and Crick on the track towards the right structure. She went on to do pioneering work on the structures of viruses.

21、 —— Nature, 2003,5. Maurice Wilkins (1916- )Like Crick, New Zealand-born Wilkins trained as a physicist, and was involved with the Manhattan project to build the nuclear bomb. Wilkins worked on X-ray crystallogra

22、phy of DNA with Franklin at King's College London, although their relationship was strained. He helped to verify Watson and Crick's model, and shared the 1962 Nobel with them.

23、—— Nature, 2003,1953年由Franklin和Wilkins等人完成的研究工作，發(fā)現(xiàn)了DNA晶體的X線衍射圖譜中存在兩種周期性反射，并證明DNA是一種螺旋構(gòu)象。,Fig. 51,6. James Watson (1928- )Watson went to university in Chicago aged 15, and teamed up with Crick in Cambridge in late 1951.

24、After solving the double helix, he went on to work on viruses and RNA, another genetic information carrier. He also helped launch the human genome project, and is president of Cold Spring Harbor Laboratory in New York.

25、 —— Nature, 2003,7. Francis Crick (1916-2004 )Crick trained and worked as a physicist, but switched to biology after the Second World War. After co-discovering the structure of DNA, he

26、went on to crack the genetic code that translates DNA into protein. He now studies consciousness at California's Salk Institute. —— Nature, 2003,典型的雙鏈DNA 二級(jí)結(jié)構(gòu),DNA右手雙螺旋結(jié)構(gòu)模式的設(shè)計(jì)者： Watson與Cri

27、ck，1953年。設(shè)計(jì)主要依據(jù)： （1）對(duì)DNA分子X(jué)射線衍射圖分 （2）堿基摩爾含量的比率關(guān)系 （3）四種堿基的理化數(shù)據(jù)分析,（二）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的要點(diǎn)：,目前已知DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)可分為：A、B、C、D（右手雙螺旋）Z型（左手雙螺旋）,B型DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模式圖,（二）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型(B型)的要點(diǎn)：,(1) 兩條反向平行的多核苷酸鏈圍繞同一中心軸形成右旋的雙螺旋結(jié)構(gòu)。(2) 堿基位于雙螺旋的內(nèi)側(cè)，平面

28、垂直于中心軸；磷酸和核糖在外側(cè)，糖平面平行于中心軸；(3) 堿基配對(duì)原則： A=T(2)，G=C(3)；(4) 螺旋參數(shù)：每螺旋10對(duì),螺距3.4nm；螺旋直徑2.0nm;(5) 小溝，大溝；,,堿基配對(duì)及氫鍵形成,,B型雙螺旋DNA的結(jié)構(gòu)特征,,（二）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型(B型)的要點(diǎn)：,(6) 螺旋的穩(wěn)定因素：氫鍵堿基堆積力堿基對(duì)平面垂直于中心軸,層疊于雙螺旋的內(nèi)側(cè).疏水性堿基堆積在一起相互吸引形成堿基堆積力。離子鍵

29、DNA分子的大?。簤A基對(duì)（bp）、分子量,二、DNA的三級(jí)超螺旋結(jié)構(gòu)及在染色質(zhì)中組裝,超螺旋結(jié)構(gòu)(superhelix 或supercoil)DNA雙螺旋鏈再盤(pán)繞即形成超螺旋結(jié)構(gòu)。正超螺旋(positive supercoil)盤(pán)繞方向與DNA雙螺旋方同相同。負(fù)超螺旋(negative supercoil)盤(pán)繞方向與DNA雙螺旋方向相反。,絕大多數(shù)原核生物的DNA都是共價(jià)封閉的環(huán)狀雙螺旋。如果再進(jìn)一步盤(pán)繞則形成麻花狀的超螺旋結(jié)

30、構(gòu)。,（一）原核生物DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)：,（二）DNA在真核生物細(xì)胞核內(nèi)的組裝：,在真核生物中，雙螺旋的DNA分子圍繞一蛋白質(zhì)八聚體進(jìn)行盤(pán)繞，從而形成特殊的串珠狀結(jié)構(gòu)，稱為核小體(nucleosome)。核小體結(jié)構(gòu)屬于DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)。,核小體的結(jié)構(gòu),核小體、染色質(zhì)與染色體,三、DNA的功能,DNA的基本功能是作為遺傳信息的載體，為生物遺傳信息復(fù)制以及基因信息的轉(zhuǎn)錄提供模板。,DNA分子中具有特定生物學(xué)功能的片段稱為基因（gene）。一

31、個(gè)生物體的全部DNA序列稱為基因組（genome）。基因組的大小與生物的復(fù)雜性有關(guān)，如病毒SV40的基因組大小為5.1×103bp，大腸桿菌為5.7×106bp，人為3.2×109bp。,1.3 RNA的結(jié)構(gòu)與功能,1.3 Structure and Function of RNA,RNA在蛋白質(zhì)生物合成過(guò)程中起著重要的作用RNA通常以單鏈形式存在，但也可形成局部的雙螺旋結(jié)構(gòu)。RNA分子

32、的種類較多，分子大小變化較大，功能多樣化。主要的RNA種類有rRNA、mRNA、tRNA、HnRNA、SnRNA、SnoRNA、ScRNA等。,一、RNA的種類、分布與功能,一、RNA的種類、分布與功能,（1）細(xì)胞質(zhì)中的RNA核糖體RNA（ribosomal RNA, rRNA）轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（transfer RNA ,tRNA）信使RNA（message RNA, mRNA）小胞漿RNA（scRNA, small cytoso

33、l RNA）線粒體RNA葉綠體RNA（2）細(xì)胞核中的RNAhnRNA(heterogeneous nuclear RNA)不均一RNAsnRNA(small nuclear RNA),小核RNA；chRNA(chromosome RNA),染色體RNA；（3）病毒RNA,RNA的種類、分布與功能,,mRNA、 rRNA 、 tRNA的功能,mRNA分子中帶有遺傳密碼，其功能是為蛋白質(zhì)的合成提供模板(templet)。

34、 mRNA分子中每三個(gè)相鄰的核苷酸組成一組，在蛋白質(zhì)翻譯合成時(shí)代表一個(gè)特定的氨基酸，這種核苷酸三聯(lián)體稱為遺傳密碼（coden)。rRNA是細(xì)胞中含量最多的RNA，占總量的80%。rRNA與蛋白質(zhì)一起構(gòu)成核蛋白體，作為蛋白質(zhì)生物合成的場(chǎng)所。tRNA在蛋白質(zhì)的生物合成過(guò)程中轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸。,二、tRNA的結(jié)構(gòu),tRNA是分子最小，但含有稀有堿基最多的RNA，其稀有堿基的含量可多達(dá)20%。tRNA是保守性最強(qiáng)的RNA。tRN

35、A是單鏈核酸，但其分子中的某些局部也可形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。,（一）tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)：,tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)由于局部雙螺旋的形成而呈現(xiàn)“三葉草”形，故稱為“三葉草”結(jié)構(gòu)。tRNA的“三葉草”形結(jié)構(gòu)包括： 氨基酸臂、DHU臂、反密碼臂、可變臂和TψC臂五部分?？繗滏I維持穩(wěn)定性。,攜帶氨基酸,辨認(rèn)并結(jié)合氨基酰tRNA合成酶,識(shí)別mRNA上的密碼,識(shí)別并結(jié)合核蛋白體,氨基酸臂,DHU臂,反密碼臂,可變臂,T?C臂,（二）tRNA的三

36、級(jí)結(jié)構(gòu)（倒L型）：,氨基酸接受臂與反密碼子環(huán)分別位于兩端； 分子上有兩個(gè)雙螺旋區(qū)； 構(gòu)象靠非螺旋區(qū)的堿基之間的氫鍵維持。,例題：1 雙鏈DNA分子量為3×107，計(jì)算：a DNA的長(zhǎng)度 b 含多少圈螺旋 c 分子的長(zhǎng)度（每對(duì)核苷酸殘基平均分子量為618）解：a L= 3×107/618 ×0.34 b n= 3

37、5;107/618 ÷10 c V=3.14 ×1.02 × 3×107/618 ×0.34,例題2: 已知某DNA溶液,堿基A占16%, 求其余堿基所含的比例。 解：因?yàn)?，A=T，G=C 所以，T=A=16% G=C=50%-16%=34%例題3：已知DNA分子的一條鏈堿基順序?yàn)椋?’GCTACGA, 寫(xiě)出其互補(bǔ)鏈的堿基順序。,第二節(jié)

38、 核酸的理化性質(zhì)、變性和復(fù)性及其應(yīng)用,Section 2 The Physical and Chemical Characters, Denaturation and Renaturation of Nucleic Acid, as well as their Applications,一、核酸的一般理化性質(zhì),兩性解離 / 一般呈酸性（在中性溶液中帶負(fù)電荷）， 微溶于水，不溶于有機(jī)溶劑 線性大分子（粘度高, 抗剪切力差

39、） 可用電泳或離子交換（色譜）進(jìn)行分離 室溫條件下，DNA在堿中變性，但不水解，RNA水解 加熱條件下，D－核糖＋濃鹽酸＋苔黑酚 綠色 D－2－脫氧核糖＋酸＋二苯胺 藍(lán)紫色,,,二、核酸的紫外吸收特性,1、紫外吸收性質(zhì) ?max=260nm2、應(yīng)用以A260/A280進(jìn)行定性、定量及純度測(cè)定： 純DNA: A260/A2

40、80>1.8 純RNA : A260/A280>2.0,二、核酸的紫外吸收特性,1、紫外吸收性質(zhì) ?max=260nm2、應(yīng)用以A260/A280進(jìn)行定性、定量及純度測(cè)定： 純DNA: A260/A280>1.8 純RNA : A260/A280>2.0DNA和RNA溶液中加入溴化乙錠（EB），在紫外下發(fā)出熒光,二、核酸的紫外吸收特性,1、紫外吸收性質(zhì) ?max=

41、260nm2、應(yīng)用以A260/A280進(jìn)行定性、定量及純度測(cè)定： 純DNA: A260/A280>1.8 純RNA : A260/A280>2.0DNA和RNA溶液中加入溴化乙錠（EB），在紫外下發(fā)出熒光減色效應(yīng),三、DNA的變性,天然核酸在理化因素作用下，其雙螺旋的氫鍵斷裂，堿基堆積力不再存在，DNA雙螺旋的兩條互補(bǔ)鏈松散而分開(kāi)成為無(wú)規(guī)則線團(tuán)狀的單鏈DNA單鏈現(xiàn)象稱為DNA的變性(denatura

42、tion)。引起DNA變性的因素： ①高溫，②強(qiáng)酸強(qiáng)堿，③有機(jī)溶劑等。,① 增色效應(yīng)(hyperchromic effect)：指DNA變性后對(duì)260nm紫外光的光吸收度增加的現(xiàn)象；② 旋光性下降；③ 粘度降低；④ 生物學(xué)功能喪失或改變。,DNA變性后的性質(zhì)改變：,加熱DNA溶液，使其對(duì)260nm紫外光的吸收度突然增加，達(dá)到其最大值一半時(shí)的溫度，就是DNA的變性溫度（融解溫度，melting temperature,

43、Tm）。,DNA的變性溫度,Tm的高低與DNA分子中G+C的含量有關(guān)，G+C的含量越高，則Tm越高。,四、DNA的復(fù)性與分子雜交,將熱變性后的DNA溶液緩慢冷卻，在低于變性溫度約25～30℃的條件下保溫一段時(shí)間（退火annealing），則變性的兩條單鏈DNA可以重新互補(bǔ)而形成原來(lái)的雙螺旋結(jié)構(gòu)并恢復(fù)原有的性質(zhì)。將變性DNA經(jīng)退火處理，使其重新形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過(guò)程，稱為DNA的復(fù)性。,DNA復(fù)性后，一系列性質(zhì)將得到恢復(fù)，但是生物活性一般

44、只能得到部分的恢復(fù)，具有減色效應(yīng)。將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時(shí)，DNA不可能復(fù)性。變性的DNA緩慢冷卻時(shí)可復(fù)性，因此又稱為“退火”。 退火溫度＝Tm－25℃復(fù)性影響因素 片段濃度/片段大小/片段復(fù)雜性（重復(fù)序列數(shù)目）/ 溶液離子強(qiáng)度,DNA的復(fù)性,兩條來(lái)源不同的單鏈核酸（DNA或RNA），只要它們有大致相同的互補(bǔ)堿基順序，經(jīng)退火處理即可復(fù)性，形成新的雜種雙螺旋，這一現(xiàn)象稱為核酸的分子雜交(hybridization

45、)。,核酸的分子雜交(hybridization),核酸雜交可以是DNA-DNA，也可以是DNA-RNA雜交。不同來(lái)源的，具有大致相同互補(bǔ)堿基順序的核酸片段稱為同源順序(homologous sequence)。,DNA-DNA雜交示意圖,DNA-RNA雜交示意圖,利用核酸的分子雜交，可以確定或?qū)ふ也煌锓N中具有同源順序的DNA或RNA片段。常用的核酸分子雜交技術(shù)有：原位雜交、斑點(diǎn)雜交、Southern雜交及Northern雜交等。

46、,五、核酸的含量與純度測(cè)定（一）核酸含量的測(cè)定1、定磷法2、定糖法（二）DNA純度的鑒定1、紫外吸收2、凝膠電泳,六、核酸的分離、純化,（一）核酸的工業(yè)化生產(chǎn)（二）活性核酸的制備注意一般原則：低溫(0-4℃)，避免強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和劇烈攪拌；抑制核酸酶的作用；用有機(jī)溶劑抽提以去除蛋白；乙醇沉淀；,抑制DNase：,可加檸檬酸鈉、EDTA等金屬螯合劑；或加去污劑 十二烷基硫酸鈉（SDS）；或加蛋白變性劑。,抑制RNa

47、se：,（1）實(shí)驗(yàn)器皿高溫，或高壓滅菌，不能高壓滅菌的用 具用0.1%二乙基焦碳酸鹽（diethyl pyrocarbonate, DEPC）處理。,（2）加強(qiáng)的蛋白變性劑如硫氰酸胍、異硫氰酸胍等。,（3）加核糖核酸酶阻抑蛋白（RNasin）等RNase的抑制劑。,3．DNA-蛋白質(zhì)（DNP）的提取,真核細(xì)胞DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合成核蛋白（DNP），RNA與蛋白質(zhì)結(jié)合成RNP，而且DNP和RNP常常混

48、在一起。利用DNP和RNP在不同濃度NaCl中溶解度的不同來(lái)分離DNP和RNP。,可用1mol/LNaCl溶液提取DNP。,相 對(duì) 溶 解 度,NaCl（mol/L）,DNP在NaCl中的溶解度,大分子DNA的提取,1．材料的選擇,2．細(xì)胞破碎,4．去蛋白質(zhì),（1）SDS,（2）苯酚法,（3）氯仿法,（4）酚:氯仿:異戊醇＝25:24:1,5．沉淀DNA,6．去雜質(zhì),（1）去RNA,（2）去多糖,7．進(jìn)一步純化,生物材料,DNP

49、（RNP）,DNP,纖維狀DNA,較純DNA,純DNA,*原核生物的DNA是裸露的，與蛋白質(zhì)結(jié)合不多，分離純化要簡(jiǎn)單些。,,破細(xì)胞,1.0mol/L NaCl*,,,去蛋白質(zhì),,酒精沉淀,,去RNA,,柱層析，電泳,密度梯度離心,去多糖,第三節(jié) 核苷酸代謝,Section 3 Metabolism of nucleotides,核苷酸(nucleotide)是構(gòu)成核酸(nucleic acid)的基本單位，人體所需的核苷酸都是由

50、機(jī)體自身合成的。食物中的核酸或核苷酸類物質(zhì)基本上不能被人體所利用。 在核酸類物質(zhì)的水解產(chǎn)物中，只有磷酸和戊糖可被吸收利用。,食物中核酸的消化,3.1 嘌呤核苷酸的代謝,3.1 Metabolism of Purine Nucleotides,一、嘌呤核苷酸的合成代謝,通過(guò)利用一些簡(jiǎn)單的前體物，如5-磷酸核糖，氨基酸，一碳單位及CO2等，逐步合成嘌呤核苷酸的過(guò)程稱為從頭合成途徑(de novo synthesis)。這一途徑

51、主要見(jiàn)于肝，其次為小腸和胸腺。 所有合成反應(yīng)在胞液中進(jìn)行。,（一）嘌呤核苷酸的從頭合成：,嘌呤堿合成的元素來(lái)源,嘌呤核苷酸合成途徑：,1、5’-磷酸核糖活化為—— 5’-磷酸核糖-1’-焦磷酸（PRPP）2、IMP的合成3、由IMP轉(zhuǎn)變成AMP，GMP,⑴ 次黃苷酸的合成：首先在磷酸核糖焦磷酸合成酶的催化下，消耗ATP，由5-磷酸核糖合成PRPP(1-焦磷酸-5-磷酸核糖)。PRPP再經(jīng)過(guò)大約10步反應(yīng)，合

52、成第一個(gè)嘌呤核苷酸——次黃苷酸（IMP）。,1．從頭合成途徑：,,次黃苷酸（IMP）的合成,合成過(guò)程,⑵ 腺苷酸及鳥(niǎo)苷酸的合成：IMP在腺苷酸代琥珀酸合成酶的催化下，由天冬氨酸提供氨基合成腺苷酸代琥珀酸（AMP-S），然后裂解產(chǎn)生腺苷酸（AMP）。IMP也可在IMP脫氫酶的催化下，以NAD+為受氫體，脫氫氧化為黃苷酸（XMP），后者再在鳥(niǎo)苷酸合成酶催化下，由谷氨酰胺提供氨基合成鳥(niǎo)苷酸（GMP）。,腺苷酸（AMP）與鳥(niǎo)苷酸（GMP）的

53、合成,⑶ 三磷酸嘌呤核苷的合成：,,核糖核苷酸還原酶的作用機(jī)制,又稱再利用合成途徑(salvage pathway)。指利用分解代謝產(chǎn)生的自由嘌呤堿合成嘌呤核苷酸的過(guò)程。這一途徑可在大多數(shù)組織細(xì)胞中進(jìn)行。,（二）嘌呤核苷酸的補(bǔ)救合成：,嘌呤核苷酸的補(bǔ)救合成過(guò)程,二、嘌呤核苷酸的分解代謝,嘌呤核苷酸的分解首先是在核苷酸酶的催化下，脫去磷酸生成嘌呤核苷，然后再在核苷酶的催化下分解生成嘌呤堿，最后在黃嘌呤氧化酶的作用下氧化生成尿酸(uric

54、 acid)，再經(jīng)尿液排出體外。,嘌呤核苷酸的分解,,,,尿酸,尿酸是嘌呤核苷酸在人體內(nèi)分解代謝的終產(chǎn)物。但在鳥(niǎo)類，尿酸則可繼續(xù)分解產(chǎn)生尿囊素。正常人血漿中尿酸含量約為0.12~0.36mmol/L (2~6mg%)。尿酸水溶性較差，當(dāng)血漿中尿酸含量超過(guò)8mg%時(shí)，即可形成尿酸鹽晶體。,痛風(fēng)癥患者由于體內(nèi)嘌呤核苷酸分解代謝異常，可致血中尿酸水平升高，以尿酸鈉晶體沉積于軟骨、關(guān)節(jié)、軟組織及腎，臨床上表現(xiàn)為皮下結(jié)節(jié)，關(guān)節(jié)疼痛等。臨床上

55、常用別嘌呤醇（allopurinol）治療痛風(fēng)癥。,黃嘌呤氧化酶,黃嘌呤氧化酶,別嘌呤醇,痛風(fēng)癥的治療機(jī)制,別嘌呤醇的分子結(jié)構(gòu)與次黃嘌呤類似，可競(jìng)爭(zhēng)性抑制黃嘌呤氧化酶的活性，從而減少體內(nèi)尿酸的生成。同時(shí)，別嘌呤與PRPP反應(yīng)生成的別嘌呤核苷酸，可反饋抑制嘌呤核苷酸從頭合成途徑的關(guān)鍵酶。,3.2 嘧啶核苷酸的代謝,3.2 Metabolism of Pyrimidine Nucleotides,一、嘧啶核苷酸的合成代謝,嘧啶

56、核苷酸從頭合成途徑（de novo synthesis)是指利用氨基酸、CO2等簡(jiǎn)單前體物逐步合成嘧啶核苷酸的過(guò)程。該合成過(guò)程主要在肝細(xì)胞的胞液中進(jìn)行。,（一）嘧啶核苷酸的從頭合成：,嘧啶合成的元素來(lái)源,⑴ 尿苷酸的合成：在氨基甲酰磷酸合成酶Ⅱ的催化下，以Gln，CO2，ATP為原料合成氨基甲酰磷酸。,1. 從頭合成途徑的反應(yīng)過(guò)程：,兩種氨基甲酰磷酸合成酶的比較,氨基甲酰磷酸在天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶的催化下，轉(zhuǎn)移一分子天冬氨酸，從而合成

57、氨甲酰天冬氨酸，然后再經(jīng)脫氫、脫羧、環(huán)化等反應(yīng)，合成第一個(gè)嘧啶核苷酸，即UMP。,UMP的合成過(guò)程,⑵ 胞苷酸的合成：,,⑶ 脫氧嘧啶核苷酸的合成：,,,由分解代謝產(chǎn)生的嘧啶/嘧啶核苷轉(zhuǎn)變?yōu)猷奏ず塑账岬倪^(guò)程稱為補(bǔ)救合成途徑 (salvage pathway)。以嘧啶核苷的補(bǔ)救合成途徑較重要。,（二）嘧啶核苷酸的補(bǔ)救合成：,二、嘧啶核苷酸的分解代謝,嘧啶核苷酸可首先在核苷酸酶和核苷磷酸化酶的催化下，除去磷酸和核糖，產(chǎn)生的嘧啶堿可在體內(nèi)進(jìn)一

58、步分解代謝。,嘧啶堿的降解過(guò)程主要在肝細(xì)胞中進(jìn)行。不同類型的嘧啶堿，其分解代謝的途徑和終產(chǎn)物不同。,（一）胞嘧啶和尿嘧啶的降解,（二）胸腺嘧啶的降解,基因信息的傳遞,DNA是由四種脫氧核糖核酸所組成的長(zhǎng)鏈大分子，是遺傳信息的攜帶者。生物體的遺傳信息就貯存在DNA的四種脫氧核糖核酸的排列順序中。,DNA通過(guò)復(fù)制將遺傳信息由親代傳遞給子代；通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯，將遺傳信息傳遞給蛋白質(zhì)分子，從而決定生物的表現(xiàn)型。DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程就構(gòu)

59、成了遺傳學(xué)的中心法則。,在RNA病毒中，其遺傳信息貯存在RNA分子中。因此，在這些生物體中，遺傳信息的流向是RNA通過(guò)復(fù)制，將遺傳信息由親代傳遞給子代，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄將遺傳信息傳遞給DNA，再由DNA通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯傳遞給蛋白質(zhì)，這種遺傳信息的流向就稱為反中心法則。,DNA dependent DNA polymerase——DDDPDNA dependent RNA polymerase——DDRPRNA dependent RNA p

60、olymerase——RDRPRNA dependent DNA polymerase——RDDP,DNA,,復(fù)制（DDDP）,轉(zhuǎn)錄（DDRP）,翻譯,RNA,,復(fù)制（RDRP）,,反轉(zhuǎn)錄（RDDP）,Section 4 DNA Biosynthesis， Replication,第四節(jié) DNA的生物合成(復(fù)制）,4.1 復(fù)制的基本規(guī)律,4.1 Basic Rules of DNA Replicatio

61、n,DNA在復(fù)制時(shí)，以親代DNA的每一股作模板，合成完全相同的兩個(gè)雙鏈子代DNA，每個(gè)子代DNA中都含有一股親代DNA鏈，這種現(xiàn)象稱為DNA的半保留復(fù)制(semi-conservative replication)。,一、半保留復(fù)制,DNA半保留復(fù)制示意圖,DNA以半保留方式進(jìn)行復(fù)制，是在1958年由M. Meselson 和 F. Stahl 所完成的實(shí)驗(yàn)所證明。該實(shí)驗(yàn)首先將大腸桿菌在含15N的培養(yǎng)基中培養(yǎng)約十五代，使其DNA中的堿

62、基氮均轉(zhuǎn)變?yōu)?5N。然后將大腸桿菌移至只含14N的培養(yǎng)基中同步培養(yǎng)一代、二代、三代。分別提取DNA，作密度梯度離心，將具有不同密度的DNA分離開(kāi)。,DNA半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)證明,DNA半保留復(fù)制研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖,按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但不是絕對(duì)的。,半保留復(fù)制的意義,DNA在復(fù)制時(shí)，需在特定的位點(diǎn)起始，這是一些具

63、有特定核苷酸排列順序的片段，即復(fù)制起始點(diǎn)(origin) 。在原核生物中，復(fù)制起始點(diǎn)通常為一個(gè)，而在真核生物中則為多個(gè)。,二、有一定的復(fù)制起始點(diǎn),細(xì)菌和酵母菌中DNA復(fù)制起始點(diǎn)的堿基序列,習(xí)慣上把兩個(gè)相鄰DNA復(fù)制起始點(diǎn)之間的DNA片段定為一個(gè)復(fù)制子(replicon) 。復(fù)制子是獨(dú)立完成復(fù)制的功能單位。DNA復(fù)制時(shí)，局部雙螺旋解開(kāi)形成兩條單鏈，這種叉狀結(jié)構(gòu)稱為復(fù)制叉。,復(fù)制起始點(diǎn)與復(fù)制子示意圖,復(fù)制起始點(diǎn)、復(fù)制子與復(fù)制叉（動(dòng)畫(huà)演

64、示）,參與DNA復(fù)制的DNA聚合酶，必須以一段具有3’端自由羥基（3’-OH）的RNA作為引物(primer) ，才能開(kāi)始聚合子代DNA鏈。RNA引物的大小，在原核生物中通常為50~ 100個(gè)核苷酸，而在真核生物中約為10個(gè)核苷酸。RNA引物的堿基順序，與其模板DNA的堿基順序相配對(duì)。,三、需要引物,DNA復(fù)制時(shí)，以復(fù)制起始點(diǎn)(origin)為中心，向兩個(gè)方向進(jìn)行解鏈，形成兩個(gè)延伸方向相反的復(fù)制叉，稱為雙向復(fù)制(bidirection

65、al replication)。但在低等生物中，也可進(jìn)行單向復(fù)制（如滾環(huán)復(fù)制）。,四、雙向復(fù)制,A. 環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點(diǎn)B. 復(fù)制中的兩個(gè)復(fù)制叉C. 復(fù)制接近終止點(diǎn)(termination, ter),DNA的雙向復(fù)制示意圖,DNA聚合酶只能以5'→3'方向聚合子代DNA鏈，即模板DNA鏈的方向必須是3'→5'。由于DNA分子中兩條鏈的走向相反，因此當(dāng)分別以兩條親代DNA鏈作為模板聚合子代

66、DNA鏈時(shí)，子代鏈的聚合方向也是不同的。,五、半不連續(xù)復(fù)制,領(lǐng)頭鏈(leading strand),隨從鏈(lagging strand),DNA的半不連續(xù)復(fù)制,以3’→5’方向的親代DNA鏈作模板的子代鏈在復(fù)制時(shí)基本上是連續(xù)進(jìn)行的，其子代鏈的聚合方向?yàn)?’→3’，這一條鏈被稱為領(lǐng)頭鏈(leading strand)。以5’→3’方向的親代DNA鏈為模板的子代鏈在復(fù)制時(shí)則是不連續(xù)的，其鏈的聚合方向也是5’→3’，這條鏈被稱為隨從鏈

67、(lagging strand)。領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制而隨從鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)制的半不連續(xù)性。,由于親代DNA雙鏈在復(fù)制時(shí)是逐步解開(kāi)的，因此，隨從鏈的合成也是一段一段的。DNA在復(fù)制時(shí)，由隨從鏈所形成的一些子代DNA短鏈稱為岡崎片段(Okazaki fragment)。岡崎片段的大小，在原核生物中約為1000～2000個(gè)核苷酸，而在真核生物中約為100個(gè)核苷酸。,2.2 Factors for DNA Replication,2.

68、2 DNA復(fù)制的條件,以四種脫氧核糖核酸(deoxynucleotide triphosphate)為底物，即dATP，dGTP，dCTP，dTTP。,一、底物(substrate),DNA復(fù)制過(guò)程中脫氧核糖核苷酸的聚合反應(yīng),DNA復(fù)制是模板依賴性的，必須要以親代DNA鏈作為模板。親代DNA的兩股鏈解開(kāi)后，可分別作為模板進(jìn)行復(fù)制。,二、模板(template),引物酶(primerase)本質(zhì)上是一種依賴DNA的RNA聚合酶（DDR

69、P），該酶以DNA為模板，聚合一段RNA短鏈引物(primer)，以提供自由的3’-OH，使子代DNA鏈能夠開(kāi)始聚合。引物酶需組裝成引發(fā)體才能催化RNA引物的合成。,三、引發(fā)體和RNA引物,在E. coli中，含有解螺旋酶(DnaB蛋白) 、DnaC蛋白、引物酶(DnaG蛋白)和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)被稱為引發(fā)體(primosome) 。,含有解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體