工業(yè)淀粉酶的純化與分析試驗報告

1、 工業(yè)淀粉酶的純化與分析一． 一．實驗目的 實驗目的1． 掌握鹽析法純化分離蛋白質(zhì)的工作原理和方法2． 掌握利用葡萄糖凝膠層析法進行蛋白質(zhì)脫鹽的技術3． 掌握測定淀粉酶活力的基本原理和方法4． 學習 Folin-酚比色法測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法二． 二．實驗原理 實驗原理工業(yè)淀粉酶含有大量雜質(zhì)將其溶解浸提后離心，利用高濃度的硫酸銨溶液將上清液的蛋白質(zhì)沉降下來，所得沉淀溶解后即為鹽析液。利用葡糖糖凝膠 G-25 對大

2、分子量蛋白質(zhì)和小分子鹽類的阻滯作用不同，從而經(jīng)凝膠層析使鹽析液中的蛋白質(zhì)和鹽類分離。酶活力是以酶在最適條件下，催化一定化學反應的初速度來表示的。在本實驗中，是以一定量的淀粉酶在 37 攝氏度，PH=6.8 的條件下，每分鐘水解淀粉酶生成 1mg 還原糖的量為一個酶活力單位，其中還原糖的量用 DNS 法測定。蛋白質(zhì)在 Folin-酚試劑的作用下生成鎢藍和鉬藍，測定其在 500nm 波長下的吸光度 ，從而求得樣品中蛋白質(zhì)的含量。三

3、． 三．實驗材料及儀器設備 實驗材料及儀器設備1． 材料：工業(yè)淀粉酶2． 儀器：電子天平；離心機；UV9100 型分光光度計恒溫水域；沸水浴3． 器材：刻度試管：25ml*21；移液管：1ml*6、5ml*1；燒杯：250ml*2、50ml*1;研缽：一套；移液槍：一套；離心管：100ml*1;1.5ml*4;7ml*1;注射器：1ml*1；層析裝置：1 套；量筒：100ml*1；洗耳球：2 個；膠頭滴管：2 個；移液管架；玻璃棒四．

4、四．實驗試劑 實驗試劑BaCl2 溶液（1%）考馬斯亮藍 G-2501%NaCl 溶液淀粉溶液（0.5%）磷酸緩沖液（0.2molr/L,pH 6.8）NaOH 溶液（2.5mol/L）牛血清蛋白（BSA）標準液（250ug/ml）Folin-酚試劑甲Folin-酚試劑乙葡萄糖標準液（1mg/ml）DNS 試劑五． 五．實驗步驟 實驗步驟1. 浸提稱取 0.317g 淀粉酶制劑，經(jīng)浸提離心后轉移上清液 1.2ml 于離心管中，標記為 “

5、粗酶液”備用。記錄剩余體積為 18.2ml 并轉移到 50ml 燒杯里，置于冰浴中。還原糖（mg） 0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 0.900 0.5092 0.9633 0.7408標準曲線 y = 0.4363x - 0.0728R2 = 0.999400.050.10.150.20.250.30 0.2 0.4 0.6 0.8 1濃度吸光值系列1線性 (系列1)5．蛋白質(zhì)含量測定粗酶液 0.5ml 加蒸

6、餾水 稀釋到 10ml，搖勻；鹽析液 1.0ml 加蒸餾水 稀釋到 10ml，搖勻；脫鹽液直接取用；樣品處理：取樣 2g 豆芽 研磨 水 100ml 定容，搖勻 浸提 10min 過濾取 14 支試管按下表操作并記錄實驗數(shù)據(jù)。空白 標準蛋白質(zhì)濃度梯度 樣品 1 粗酶液 鹽析液 脫鹽液0 1 2 3 4 5 A1 A2 B1 B2 C1 C2 D1 D2 BSA 標準液(ml) 0.0 0.