gfr／ddr2嵌和受體的構(gòu)建和穩(wěn)定表達(dá)的鑒定

1、第 U 軍 I 矢人學(xué) 、： 報(bào) ( JF o u r l hM i lM e dU n i x ) 2 0 0 4 ； 2 5 ( 1 2 ) h t t p ： ／!． !| 盯．． f 1· 研究 原 著 ·G F lD D R 2嵌 和 受體 的構(gòu) 建 和 穩(wěn) 定 表 達(dá) 的 鑒定 蘇 金 ， 于江天 ， 王吉村 ， 史 曼， 朱 玲 ， 張 健 ， 劉新平 ， 藥立波 ( 第 四軍 醫(yī)大學(xué) 基礎(chǔ)部生物

2、化學(xué) 與分子 生物學(xué)教研室 ， 陜西 西安 7 1 0 0 3 3 )文章編號(hào) ： 1 0 0 0 - 2 7 9 0 ( 2 0 0 4 ) 1 2 — 1 0 6 1 - 0 4Co n s t r u c t i o na n ds t a b l ee x p r e s s i o nEGF R／ DDR2c h i m e r i cr e c e p t o ro f【 關(guān)鍵詞】盤狀結(jié)構(gòu)域受體； 嵌和受體； 金屬蛋白酶類；

3、 基因 表達(dá) 【 中圖號(hào) 】 R 3 4 9 ． 8 2【 文獻(xiàn)標(biāo) 識(shí)碼 】 ASUJ i n，Y UJ i a n g — T i a n，WA NGj i — Cu n，S HIMa n，ZHU L i n g，ZH A NGJ i a n． L I U X i n — PgY AOL i — BoDe p a r t me n to fBi o c h e mi s t r y& Mo l e c u l a rBi

4、o l o g y．S c h o o lo fB a s i cMe d i c i n e， F o u ~hMi l i t a r yMe d i c a lUn i v e r s i t y ， Xi ’ a n7 1 0 0 3 3，C h i n a【 A b s t r a c t】A I M ： T oa n a l y z eD D R 2s i g n a lp a t h w a yb ya —v o i d

5、i n ga c t i v a t i n gar e l a t e df a m i l ym e m b e rw i t ht h es a m e¨ g —a n da sDDR 2．M ET HODS：Th eEGFR ／DDR 2c h i mer i cr e —c ep t o rwa sf u s e db yPCRamp l i f i c a t i o nan de n z y med i g e

6、s —t i o na n dt h e ns t ab l yt r a n s f e c t e dt o2 9 3c e l ll i n ewi t hr e l a t i v e l yl o w E GF R e x p r e s s i o n ．Af t e rs c r e e n i n gwi t hG41 8，p o s i t i v ec l o n e st h a ts t ab l ye x

7、p r e s st h i sc h i mer ao nt h em e mb r a n ewe r ei d e n t i f i e db yf l o wc y t o me t r y ( F CM) ．R E S U L T S：E G—F FDDR 2c h i mer i ce x p r e s s i n gp l a s mi dwass u c c e s s f u l l yc o n s t r u

8、c t e dan dt h ec l o n es t a b l ye x p r e s s i n gt h ep l a s mi dwa ss c r e e n e d ． CONCLUS I ON：T h eE G F R／ DDR2c h i m e r i cr e c e p t o rh a sb e e nf u s e da n ds t ab l ye x p r e s s e d．【 K e y w o

9、 r d s】d i c o r d i nd o m a i nr e c e p t o r ； c h i m e r i cr e c e p t o r ；me t al l O p r O t e i n a s e s；g e n ee x p r e s s i o n【 摘 要 】目的： 將 一 在細(xì) 胞膜 表 面不 表達(dá) 或低 表達(dá) 的受 體 胞外 區(qū)與盤狀 結(jié)構(gòu)域受體 2 ( D D R 2 ) 的胞 內(nèi) 區(qū)融 合

10、 ， 構(gòu)建 一嵌 和 D D R 2受體 ， 避 免在 活化 此受 體 的 同時(shí) 激活 與 D D R 2 有 相 同配體 的受體 介導(dǎo) 的信 號(hào)通 路 ， 為探 索 D D R 2介 導(dǎo) 的胞 內(nèi)信 號(hào)途徑 奠定基 礎(chǔ)．方法 ：采用 P C R擴(kuò) 增 和 限制 性 酶 切 的方 式 ， 將表 皮生長(zhǎng) 因子 受體 ( E G F R ) 的胞外 區(qū)與 D D R 2的跨 膜及 胞 內(nèi)區(qū)進(jìn)行融 合并 穩(wěn)定 轉(zhuǎn)染 E G F R低表 達(dá) 的

11、 2 9 3 細(xì) 胞 ， G 4 ] 8篩選 ， 流式細(xì)胞儀檢 測(cè)嵌和受體 在膜 表面 的表達(dá) 狀況 ． 結(jié) 果 ：成功構(gòu) 建了 E G F R ／ D D R 2嵌 和 表達(dá) 載體 ； 篩選 到 穩(wěn) 定表 達(dá)此 嵌和受體 的 2 9 3細(xì) 胞株 ．結(jié) 論 ： 融 合并 穩(wěn) 定 表 達(dá) 了 E G F R ／D D R 2嵌 和受體 ．收稿 日期 ： 2 0 0 3 ． 1 2 - 0 8 ； 修 回 日期 ： 2 0 0 4 - 03

12、 - 3 0基金項(xiàng) 目： 國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ) 研究 和開 發(fā)計(jì)劃 ( 2 0 0 2 C B 5 1 3 0 0 7 ) ； 國(guó)家 自然 科學(xué) 基金 資助項(xiàng) 目( 3 0 3 0 0 3 1 9 )通訊作者 ： 藥立 波． T e 1 ． ( 0 2 9 ) 8 3 3 7 4 5 1 3E m a i l ． b i o y a o @f m m u ． e d uC B作者簡(jiǎn) 介： 蘇 金( 1 9 7 8 一 ) ， 女( 漢族 ) ，

13、 山東省萊州 市人．碩士 生 ( 導(dǎo) 師 藥立 波 ) ．T e 1 ．( 0 2 9) 8 3 3 7 4 5 1 6E x t ． 1 1E ma i ls u j i n 9 2 3@ f m mue dl 1 ． c n0引言 盤狀結(jié)構(gòu)域受體 2 ( D D R 2 ) 屬于一種受體 型蛋 白酪氨酸激酶 ， 可被天然纖維 型膠原活化 ， 從而介 導(dǎo) 基質(zhì)金屬蛋 白酶 1 ( M M P 一 1 ) 的表達(dá) ．我 們的前期 研 究

14、 發(fā)現(xiàn) ， D D R 2在 類 風(fēng) 濕 性 關(guān) 節(jié) 炎 ( R A) 成 纖 維 樣滑膜細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài) ， 并具有較高的磷酸化水 平．由于關(guān)節(jié)軟骨的主要成分為 Ⅱ型膠原 ， 因此我們 提 出， Ⅱ型膠原一 D D R 2 一 M M P 一 1通路 中的關(guān) 鍵分子 可 能成為減輕 R A關(guān) 節(jié)軟 骨破 壞 的藥物作 用靶 位 J ．已有研 究 表 明， D D R 2能 結(jié) 合 S r c ／ S h c從 而 上 調(diào) MM P

15、一 2的 表 達(dá) 水 平 ．然 而 ， 對(duì) 于 Ⅱ 型 膠 原 一 D D R 2 ，M M P 一 1 通路所知甚少．鑒 于膠 原受體 的多樣性 ，為確切闡明 D D R 2 介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)通路 ， 我們采用嵌 和受體策略 ， 即將一在細(xì)胞 中不表達(dá)或低表達(dá)的受體 胞外 區(qū)與 D D R 2的跨膜和胞 內(nèi)區(qū)融合 ， 通過胞外 區(qū)分 子的配體 活化 D D R 2 ， 進(jìn)而研究其詳盡的通路．1 材料和 方法 1 ． 1 材 料 R

16、A成 纖 維 樣 滑 膜 細(xì) 胞 標(biāo) 本 、 p c D N A 3 ． 1( 一 ) 真核 表 達(dá) 載 體 、 大 腸 桿 菌 D H 5 a 菌株 ( 本室 保 存 ) ； R N A反 轉(zhuǎn) 錄試 劑 、 p f x高保 真 聚合 酶 、 L i p o f e c t ．m i n( 1 n v i t r o g e n公 司 ) ； D M E M 培 養(yǎng) 基 、 Z e o c i n ( G i b ．C O 公司) ；

17、抗 E G F Rm A b ， F I T C標(biāo)記 的羊抗 鼠第二抗 體( S a n t aC r u z 公司) ； 用于 P C R反應(yīng)的引物( 上海生 物工程公司合成 ) ； T a q 酶 、 d N T P ， d A T P 、 各種 限制性 內(nèi)切酶 、 p M D 1 8 一 T載體 、 TD N A連 接 酶 ( T a k a r a公 司 ) ； 質(zhì)粒提取 和 D N A回收試劑盒( 上海華舜公司) ．1 ． 2

18、 方法 1 ． 2 ． 1引物設(shè) 計(jì) E G F R 的胞 外 區(qū)片段 ( 命 名 為 E E ) 上游引物序列 ： 5 ， _ T C TA G AG A CT C CG T CC A GT A TT G AT C GG G AG A GC 一 3， 其中 T C TA G A為 X b aI 酶切位點(diǎn)． E G F R的下游引物序列： 5 ' - T C G C G AC G GG A TC I TA G GC C CA 1

19、 丫 rC G TT G GA C 一 3， 在 序列 中引 入 T C G ， 同時(shí)將 E G F R胞外區(qū)最后一個(gè)氨基酸殘基密 碼子的第 3 個(gè)堿基 突變?yōu)?C ， 此 時(shí) T C GC G A形成一 維普資訊 http://www.cqvip.com 2 A 1 ， I DP C R 產(chǎn) 物 為 13 7 0b p的特 異 性 條 帶 【 F i g2 B ) ．測(cè)序結(jié)果 表明， P C R擴(kuò)增 獲得并 克隆的 E E和 1 DD

20、 N A片段序列完 全正確 p M D 1 8 - T — E E可 用于拼 接的克隆通 過 E c o RI 酶 切 ． 切 出 1 6 0 0b p條帶 ( F i g2 c第 1 泳道 ) ． 利用 p MD 18 - T載體多 克隆位 點(diǎn) 處的 H i n d I g 和 X b aI 對(duì) l D片段進(jìn) 行鑒定 ， 切出預(yù) 期 13 7 0b p的條帶( F i g2 D )F ^ ： 1 0：S e l e c i ~ Le

21、ll e ?o f0 Ⅱ 山 ? I #1 0 1 8 - T - E G F R ／ D D R 2d i g e s t e d· yB u mHl ⅢHir M Ⅲ ；M：Ma r k e r ． B ：1 ：E G F I L , ' D D R 2 一 p r DNA 3I一 ld jb X k 1a n d帥 I； M：M a r k e rnE3l d e n t i f i c a f i O 1 3

22、o fr e c o mb i n a n tp MDI 8 一 T- E GF R ／DDR 2a n dE GF R／ DDR2 一 p e DNA3l f ． )圖 3p MD 1 8 - T - E G F [ L ~ D D R 2 和 E G F i ~ ／ I ) D B 2 · F ~ - D N , ． ％ 1 ． 1 ( 一 1重組 質(zhì)粒的酶 冊(cè)鑒 定 2 ． 4E G F R ／ D D I ~ 嵌和 受

23、體 的穩(wěn)定 表達(dá) 流式細(xì) @胞術(shù)可 以檢測(cè)到細(xì)胞表面的 E G F I L ／ D B R 2嵌和受體 ， 表 明其 已經(jīng) 穩(wěn)定表達(dá) 于 2 9 3細(xì)胞 中( F i g4 ) ， 并且此 嵌和受體可 以正確折疊 ． 表達(dá) 于細(xì)胞外喪面 ． 表明構(gòu) 建的嵌 和受體可能具有正確 的生物學(xué)功能．固 A ：1：EE P CR f r a g me n l ： M ： Ma r k e rH： I： I Df r a g me tn la

24、 i i t p ] i f ir dl ' v『 1 CR ； M ： M a r k e r ． ( ： ： I 一 3 ：S e l e e t ~lc l o nfM I I ml l i n a n lE E — p MD I8 ．rd i g e s l m ]w i t hE c o R I；M：ma r k e rD： 1 ：I D i I I 洲 jr l ⅥDI8 - Tl [ ~ n t eI i ．州

25、 1w i t hⅢ ． X ／ m[i l ll a t 1 PI ：M：Ma r k e tF i g2I d e n t i f i c a t i o n, i fP CRp r o d L wl Sa Ⅲlo r t ~ b [ n a n lp MD18 - Tv e c | o rh ’e n z y med i g e s l in l “圖 2P C R產(chǎn)物及重 組載 伴的 鑒定2 ． 2E G F R ／ D D R

26、 2嵌 和 片 段 的 拼 接 拼 接 后 的 P MDI 8 - ' 1 “ 一 E G F R ／D DR 2以 B a r nHI和 H i n d9 1 酶 切 ． 出 現(xiàn) l 8 0 5 ， I l 6 03 4 0b p的 片 段 ， 說 明 I I )已 連 人 p M D I8 - T - E El 寸 】 ( F i g3 A第 l 泳道 ) ． 反之則 只切 出一 1 、 l l 60 b p的 片段 ( F

27、 i3 A第 2泳道 )2 ． 3E GF R ／ D D R 2 · p c D N A 3 ． 1 ( 一】 真核表達(dá)載體 的 構(gòu)建 拼接 成 功后 的 E G F ~ ／ D D R 2嶷 和 片段 經(jīng) 肼 JI．nI雙酶切 ， 回收 3 4 0 0b p的 片段連 入真核 表 達(dá)載1 本p e D N A 3 ． I {一) ．肼 I和 母 l 酶 切鑒定 表 明 E G F R ／ D D R 2 一 p c D

28、N A 3l ( 一) 構(gòu)建成功 ( F ； 口 3 B )^：C e l l s I 姐l lc 。 1I~ , i t hr Ch i l l np h t ． m i d ：1 3 ： E e i l smI I fn 曲 ^ MIdw i t h[ 1m l i d1 1 2c k i n me f i ce x p r ~ i o np l a ： ． mi dF i g4An a l y s i so fE( ； F R

29、 ／ DDR 2c h i me r l t · r e c e p t o re x p r e s s i o nO ／ 1I h eS ． I J t r a c eo f2 9 3e dll i n e圈 4E G F R ／ D D R 2 嵌 和受 捧表達(dá)分析 3 討 論 我們選 用 E c F R 的胞外區(qū) 與 D D R 2的胞 內(nèi)區(qū)及 跨膜 區(qū)并將其在基 因水平融臺(tái) ． 期望獲得兩者的融合 表達(dá)形成嵌臺(tái)受體