葡萄糖氧化致血管收縮及其線粒體機(jī)制.pdf

1、背景：在糖尿病等代謝紊亂疾病中血管并發(fā)癥高發(fā)，這與血管的收縮和舒張功能受損有關(guān)。代謝紊亂的長期刺激（高糖、高胰島素）首先損傷內(nèi)皮細(xì)胞，而后影響血管功能。同時，控制飲食、減少體重、增加鍛煉等方式可以有效改善血管功能。這說明代謝與血管功能密切相關(guān)。在生理?xiàng)l件下，代謝會對血管收縮舒張功能產(chǎn)生何種作用？在糖尿病等病理?xiàng)l件下，其作用是否會發(fā)生改變?代謝紊亂又與高血壓的產(chǎn)生有何種聯(lián)系？
　　葡萄糖是血管維持收縮的主要能量來源。與其它組織不同，

2、血管中葡萄糖代謝的主要方式是無氧酵解，但越來越多的證據(jù)表明線粒體參與調(diào)節(jié)血管的收縮作用。比如，血管平滑肌細(xì)胞的線粒體分裂增加引起血管收縮。那么線粒體在葡萄糖代謝引起的血管功能改變中會起到何種作用？在糖尿病中，上述作用又會出現(xiàn)何種改變？這都是吸引我們進(jìn)行本課題的原因。
　　目的：本研究旨在明確血管組織自身葡萄糖代謝是否影響血管收縮舒張功能。若是，進(jìn)一步探究其主要作用機(jī)制及意義。
　　方法及結(jié)果：
　　1.本實(shí)驗(yàn)招募8名健

3、康成年男性，年齡20-30歲之間，觀察在糖耐量實(shí)驗(yàn)過程中，血壓、肱動脈血管口徑、心排出量的變化。發(fā)現(xiàn)口服葡萄糖（1.0g/kg）后30min，血糖和肱動脈血壓明顯增高，超聲檢測顯示肱動脈血管口徑顯著減少，但每搏輸出量、心率和心輸出量并未發(fā)生明顯改變。服糖后90min，血糖、血壓和血管口徑恢復(fù)正常。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)血糖分別與血壓（P=0.02）和血管口徑（P=0.03）有較好的相關(guān)性。上述結(jié)果提示葡萄糖引起的血壓增高可能與血管收縮有關(guān)。

4、r>　　2.為觀察葡萄糖對血管的直接作用，我們分離了小鼠的胸主動脈。發(fā)現(xiàn)葡萄糖（30mM）可以誘導(dǎo)血管收縮。甘露醇的對照實(shí)驗(yàn)顯示，上述現(xiàn)象并非由滲透壓引起。然而血管在生理及大多數(shù)病理環(huán)境中并不存在30mM葡萄糖，在體環(huán)境中伴隨葡萄糖升高會有胰島素的增加，因此我們又采用了葡萄糖和胰島素的混合液（glucose10mM和insulin10nM，G+I）。血管張力結(jié)果顯示，G+I可以誘發(fā)與30mM葡萄糖相同的血管收縮幅度。有趣的是，與30mM

5、葡萄糖引起的血管持續(xù)收縮不同，G+I引起的血管收縮是短時性的，這與在體葡萄糖引起的血管收縮時程類似，說明離體中G+I可以更好地模擬葡萄糖的在體刺激。
　　3.為明確是內(nèi)皮還是平滑肌在其中起主要作用，我們進(jìn)一步采用機(jī)械法去除血管內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)有無內(nèi)皮并不影響30mM葡萄糖或G+I所致的血管收縮作用。說明平滑肌而非內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)了葡萄糖引起的血管收縮。進(jìn)一步我們分離原代小鼠胸主動脈血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth musc

6、le cells，VSMCs），檢測調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞收縮的關(guān)鍵蛋白--肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）的磷酸化水平。發(fā)現(xiàn)30mM葡萄糖或G+I都可以引起MLC的磷酸化水平增加，而給予α-CCA（線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑）抑制丙酮酸進(jìn)入線粒體后，上述作用消失。這說明平滑肌細(xì)胞線粒體參與的葡萄糖氧化介導(dǎo)了血管收縮。
　　4.線粒體是葡萄糖代謝的中心環(huán)節(jié)，其產(chǎn)生ATP以維持平滑肌細(xì)胞收縮。在血管平滑肌細(xì)胞中，3

7、0mM葡萄糖或G+I都可以增加線粒體的耗氧量及電子供體NADH和FADH2，并且G+I的增加幅度更高，因此之后的實(shí)驗(yàn)采用G+I作為增加葡萄糖氧化的方法。為明確線粒體如何介導(dǎo)血管收縮，我們采用了FCCP（H+載體），Valinomycin（K+載體），Nigericin（H+/K+交換體）和Monesin（H+/Na+交換體），分別干預(yù)線粒體膜電位（△Ψm）、質(zhì)子梯度、ATP、K+和Na+等，觀察線粒體的何種組分參與血管收縮，最終發(fā)現(xiàn)△Ψ

8、m的變化與血管的收縮舒張趨勢一致。而后，用NH4Cl直接增加△Ψm可引起血管收縮；用CH3COONa直接降低△Ψm可導(dǎo)致血管舒張。同時我們發(fā)現(xiàn)，G+I可以增加原代平滑肌細(xì)胞的△Ψm以及離體血管平滑肌的△Ψm，而FCCP（降低△Ψm）或Nigericin（維持△Ψm相對恒定）預(yù)處理后，G+I對平滑肌細(xì)胞△Ψm的增加作用消失，并且G+I對血管的收縮能力也顯著下降。上述結(jié)果說明葡萄糖氧化通過增加平滑肌△Ψm引起血管收縮。
　　5.那么葡

9、萄糖氧化增高△Ψm是如何進(jìn)一步調(diào)節(jié)血管收縮的呢？我們關(guān)注到MLC的調(diào)節(jié)因素上。目前主要有兩條通路介導(dǎo)MLC的磷酸化：Ca2+依賴的肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinases，MLCK）和Ca2+非依賴的Rho蛋白激酶（Rho kinase，ROCK）。干擾Ca2+的作用（BAPTA-AM，TG預(yù)處理）后，G+I的血管收縮作用依舊存在，而阻斷ROCK（Y27632，F(xiàn)asudil預(yù)處理）可以抑制G+I的血管收縮

10、作用，說明ROCK通路在其中起主要作用。ROCK蛋白的上游調(diào)節(jié)因子主要是Rho蛋白家族，我們發(fā)現(xiàn)G+I并未改變胞漿中的RhoA的活性，卻增加了線粒體上的Rho蛋白miro（mitochondrial Rho）的活性。為進(jìn)一步探究miro在血管收縮調(diào)節(jié)中的作用，我們給予miro-siRNA下調(diào)miro表達(dá)后，G+I誘導(dǎo)的MLC磷酸化水平下降；給予miro-adenovirus上調(diào)miro表達(dá)后，G+I誘導(dǎo)的MLC的磷酸化水平增加。另外，增

11、加△Ψm時，miro的活性增加；而降低△Ψm時，miro的活性下降。上述結(jié)果說明葡萄糖氧化引起的血管收縮主要通過△Ψm-miro介導(dǎo)的ROCK-MLC通路激活引起。
　　6.在明確葡萄糖氧化引起血管收縮后，我們進(jìn)一步探討上述機(jī)制是否介導(dǎo)糖尿病血管功能障礙。采用STZ和高脂飲食誘導(dǎo)的糖尿病大鼠進(jìn)行糖耐量實(shí)驗(yàn)（2.0g/kg，腹腔注射）。發(fā)現(xiàn)給予葡萄糖后90min血糖、胰島素、尾動脈血壓仍維持在較高水平，同時伴隨著腹主動脈出現(xiàn)持續(xù)收縮

12、。分離db/db小鼠的胸主動脈進(jìn)行離體實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)G+I引起db/db小鼠血管收縮的時間延長（P=0.03）。并且離體血管△Ψm的變化與血管張力的變化有相似的趨勢：G+I處理后，對照小鼠出現(xiàn)短時的△Ψm增高，而db/db小鼠△Ψm增高的時間顯著延長。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，G+I刺激后30min時db/db小鼠ROCK的下游MYPT-1和MLC的磷酸化仍在較高水平，而對照組已經(jīng)恢復(fù)到處理前的水平。上述結(jié)果表明，在葡萄糖氧化刺激時，糖尿病血管收縮時間延