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文檔簡介
1、透明質酸(Hyaluronic acid,HA)是由葡萄糖醛酸與N-乙酰氨基葡萄糖組成的雙糖單位重復連接而成的微生物多糖,作為一種生物高分子聚合物,透明質酸由于其自身的優(yōu)良特性,在醫(yī)藥、化妝品、食品保健等領域得到廣泛研究與應用。分子量顯著影響透明質酸理化特性與應用效果。高分子量HA(Mr>2×106Da)一般應用于醫(yī)藥領域,而低分子量HA(Mr<1×106Da)一般應用于化妝品和食品領域。通常,分子量越高,價格越高。
微生物發(fā)
2、酵法是目前透明質酸的主要生產方法,本研究以Streptococcuszooepidemicus為發(fā)酵菌株,通過考察營養(yǎng)條件、培養(yǎng)條件以及細胞膜通透性對透明質酸發(fā)酵的影響,篩選出透明質酸分子量的顯著影響因素,并將其進行優(yōu)化組合,最終獲得高產量和高分子量統(tǒng)一的發(fā)酵工藝。本論文主要研究內容如下:
第一,基于透明質酸代謝途徑的特性,先后考察了碳源、氮源、多聚磷酸鹽、丙酮酸鈉對透明質酸分子量的影響。結果發(fā)現(xiàn):采用分批培養(yǎng)的方式同時保持較
3、高水平的葡萄糖(70g/L)供給,可以有效緩解菌體生長與透明質酸合成對于共用資源-葡萄糖的競爭,有利于高分子量透明質酸的合成,透明質酸分子量最高可達1.63MDa;提高有機氮源酵母粉的濃度(起始水平10g/L)以及流加氨水均不利于高分子量透明質酸的合成;向透明質酸發(fā)酵體系中添加較高聚合度的多聚磷酸鹽((NaPO3)6)可以弱化菌體生長與透明質酸合成的能量競爭,當(NaPO3)6添加量為3g/L,分子量最高可達2.27MDa;較高濃度的丙
4、酮酸鈉可以顯著減弱糖酵解與透明質酸合成途徑對共用資源的競爭,促進高分子透明質酸的合成,當其添加量為8g/L時,分子量最高可達2.14MDa,將上述營養(yǎng)強化策略組合應用于透明質酸的發(fā)酵,最終產量和分子量分別達到5.58g/L和2.35MDa,比優(yōu)化前各自提高了20%和44.2%。
第二,從pH、溫度、通氣和攪拌速率四個方面考察了培養(yǎng)條件對于透明質酸分子量的影響。pH和溫度顯著影響透明質酸產量和分子量,當pH=7時,透明質酸產量最
5、高,達到4.71g/L,當pH=8時,透明質酸分子量最大,達到2.28 MDa,;當溫度在37℃條件下時,透明質酸產量最高,當溫度在31℃時,透明質酸分子量最大,達到2.34MDa;通氣和攪拌速率顯著影響透明質酸產量和分子量,當攪拌速率為600rpm,通氣速率為1vvm時,透明質酸產量和分子量同時達到最高值。基于此,提出溫度和pH兩階段調控發(fā)酵策略,顯著提升了透明質酸的產量和分子量。將該策略和營養(yǎng)強化策略結合,最終產量和分子量分別達到了
6、5.65g/L和2.5 MDa。
第三,考察表面活性物質和磷脂類物質對透明質酸分子量影響。先后比較了陽離子型表面活性劑CPC、陰離子型表面活性劑SDS、非離子表面活性劑吐溫-60以及磷脂酰膽堿對透明質酸發(fā)酵的影響,結果發(fā)現(xiàn)添加磷脂酰膽堿可以顯著改善透明質酸的結果,在發(fā)酵的第8小時添加150mg/L的磷脂酰膽堿可以使透明質酸產量和分子量達到最高的2.54MDa。最后將磷脂酰膽堿添加與營養(yǎng)強化和兩階段調控培養(yǎng)策略結合應用于透明質酸
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