低分子量透明質(zhì)酸在早期肝臟缺血-再灌注損傷中的作用及機(jī)制.pdf

1、目的：探討肝臟缺血缺氧的代謝改變?cè)诨謴?fù)灌注時(shí)發(fā)展成為再灌注損傷時(shí)低分子量透明質(zhì)酸的作用及機(jī)制,探討肝臟缺血再灌注(HepaticIschemic/Reperfusioninjury,HIRI)損傷過(guò)程中由缺血造成的代謝性改變發(fā)展成再灌注損傷這種肝臟炎癥反應(yīng)的機(jī)制,分析低分子量透明質(zhì)酸(LowMolecularWeight-HyaluronicAcid,LMW-HA)在這個(gè)過(guò)程中扮演的角色,探索肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(Liversinusoidal

2、endothelialcells,LSEC)、肝臟枯否細(xì)胞(Kupffercell,KC)的作用。
　　方法：1.運(yùn)用酶解法制備LMW-HA,分離小鼠肝臟LSEC和KC細(xì)胞,離體培養(yǎng);2.在離體LSEC和KC常規(guī)共培養(yǎng)(37℃,5％CO2)的條件下,給予LMW-HA刺激,并設(shè)置相關(guān)對(duì)照組,檢測(cè)p38絲裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activatedproteinkinase,p38MAPK)、核因子-kappaB(Nuc

3、learfactor-κ-genebinding,NF-κB)、腫瘤壞死因子-α(Tumornecrosisfactor-α,TNF-α)水平;3.在缺氧培養(yǎng)的條件下檢測(cè)缺氧環(huán)境導(dǎo)致LSEC對(duì)高分子量透明質(zhì)酸(HighMolecularWeight-HyaluronicAcid,HMW-HA)攝取代謝能力的變化4.在離體LSEC和KC缺氧(37℃,5%CO2,95N2)再氧化(37℃,5%CO2)共培養(yǎng)的條件下,給予HMW-HA刺激,設(shè)

4、置給予抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC,NL)或者LMW-HA抑制物PEP-1組,檢測(cè)活性氧(ReactiveOxygenSpecies,ROS)、TNF-α水平。
　　結(jié)果：1.運(yùn)用熒光輔助碳水化合物電泳(Fluorophore-assistedcarbohydrateelectrophoresis,FACE)方法檢測(cè)證明收獲分子量為小于20個(gè)雙糖的的LMW-HA,運(yùn)用免疫熒光(Immunofl

5、uorescence,IF)及掃描電鏡(Scanningelectronmicroscopy,SEM)的方法分別證明收獲LSEC及KC細(xì)胞;2.通過(guò)離體LSEC和KC常規(guī)共培養(yǎng)體系,我們觀察到LMW-HA本身無(wú)法被LSEC攝取代謝,只能作為內(nèi)源性配體激活KC誘發(fā)炎癥系統(tǒng)激活,表現(xiàn)為促進(jìn)p38MAPK磷酸化及NF-κB活化及TNF-α的釋放,而HMW-HA本身在常規(guī)共培養(yǎng)體系中缺乏信號(hào)分子作用。3.缺氧可以抑制LSEC攝取代謝HMW-HA

6、的能力,且隨著時(shí)間延長(zhǎng)這種抑制作用更為明顯。4.在離體LSEC和KC缺氧再氧化的共培養(yǎng)體系中,缺氧再氧化過(guò)程可誘生ROS增加,抗氧化劑NAC可以阻斷ROS的產(chǎn)生;這些釋放的ROS將裂解HMW-HA形成LMW-HA,并誘導(dǎo)KC細(xì)胞活化,釋放TNF-α。
　　結(jié)論：在機(jī)體缺血性損傷階段,由于LSEC的損傷,造成HWM-HA在缺氧臟器內(nèi)蓄積,而在再灌注早期將產(chǎn)生的大量ROS,這些ROS可以降解HMW-HA為L(zhǎng)MW-HA,成為早期激活KC