協(xié)和醫(yī)科大學(xué)考博分子生物學(xué)精選

1、重要實(shí)驗(yàn) 重要實(shí)驗(yàn)1、RNA 酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)（RNase protection assay）：它在許多方面與 S1 核酸酶分析方法類似。它是用人工合成的具 35S 或 32P 標(biāo)記的反義 RNA 探針同目的 mRNA 雜交，所形成的雙鏈體分子用只切割單鏈的 RNaseA 和 RNaseT1 消化，之后將仍保留著的 RNA 做大小分部分離，于是被保護(hù)的 RNA 探針便給出了在樣品中存在的目的 mRNA 的大小數(shù)值。此法同樣可鑒定樣品中 mRN

2、A 的數(shù)量。2、DNA 酶足跡法（DNase footprinting）：也叫足跡實(shí)驗(yàn)（footprinting assay） ，是一種用來檢測被特定蛋白特異性結(jié)合的 DNA 序列的位置及其核苷酸序列結(jié)構(gòu)特征的實(shí)驗(yàn)方法?；驹恚寒?dāng) DNA 分子中的某一區(qū)段同特異蛋白結(jié)合之后，便會(huì)得到保護(hù)而免受 DNaseⅠ的切割作用，結(jié)果不會(huì)產(chǎn)生出相應(yīng)長度的切割分子，于是在凝膠電泳放射自顯影圖片上便會(huì)出現(xiàn)一個(gè)空白區(qū)，俗稱“足跡” 。通過與沒有蛋白保護(hù)

3、的對照 DNA 序列比較，便可得知相應(yīng)于足跡部位的核苷酸序列結(jié)構(gòu)。3、S1 核酸酶定位法（nuclease S1 mapping）：用于揭示 mRNA 序列結(jié)構(gòu)特征的一種技術(shù)。將從一個(gè)克隆基因分離的經(jīng)放射性標(biāo)記的單鏈 DNA 片段同其相應(yīng)的 mRNA 退火形成雙鏈分子，然后用 S1 核酸酶消化此雜合分子上未互補(bǔ)配對的單鏈序列，再用 PAGE 及放射自顯影方法，檢測保留下來的 DNA片段的分子大小。此法可測定克隆基因中的內(nèi)含子數(shù)目及大體位

4、置，mRNA 分子的 5’端位置及mRNA5’端任何不均一性的程度。4、染色體步移（chromosome walking）：借助反向 PCR（inverse PCR）通過使部分序列已知的限制片段自身環(huán)化連接，然后在已知序列部位設(shè)計(jì)一對反向引物，經(jīng) PCR 而使未知序列得到擴(kuò)增。重復(fù)進(jìn)行反向 PCR，從染色體已知序列出發(fā)，逐步擴(kuò)增出未知序列，稱染色體步移。5、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)（gel retardation assay）：又叫 DNA 遷移率

5、變動(dòng)實(shí)驗(yàn)（DNA mobility shift assay） ，或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（electrophoretic mobility shift assay，EMSA） ，或條帶阻滯實(shí)驗(yàn)（band retardation assay） 。它是根據(jù)裸露的 DNA 與結(jié)合有某種蛋白的相同大小的 DNA 在電泳中具有不同的遷移率（DNA-protein 復(fù)合物由于具有較高的分子量，因此通過凝膠的速度要比裸露的 DNA 緩慢）這一原理，在

6、20 世紀(jì) 80 年代初期設(shè)計(jì)出來的用于檢測與特定 DNA 片段相結(jié)合的特定蛋白的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。目前也可用于 RNA 結(jié)合 protein 的研究。6、甲基化干擾實(shí)驗(yàn)（methylation interference assay）：根據(jù) DMA 能使 G 殘基甲基化，而六氫吡啶又能特異地切割甲基化的 G 殘基這一原理設(shè)計(jì)的，用于研究 protein 與 DNA 相互作用的一種有效的辦法。7、Western blotting：即蛋白質(zhì)印跡

7、（protein blotting） ，是用來檢測在不均一的蛋白質(zhì)樣品中，是否存在目標(biāo)蛋白質(zhì)的一種技術(shù)。其操作程序與 Southern blotting 十分類似。先將蛋白質(zhì)作變性 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到諸如硝酸纖維素濾膜一類的固體支持物上，通過專一性抗體探測目標(biāo)蛋白質(zhì)。隨后再用一種標(biāo)記的第二抗體（如 125I 標(biāo)記的或生物素化的羊抗兔的 IgG）檢測在印記中存在的免疫復(fù)合物（即第一抗體與抗原復(fù)合物） 。由于本法是在

8、變性和還原條件下進(jìn)行凝膠電泳，因此目標(biāo)蛋白質(zhì)的分子大小是可被檢測出的。名詞解釋一 名詞解釋一1、小分子 G 蛋白：單體蛋白，分子量 20-30kD，與一般 G 蛋白 α 亞基有高度同源性并具有相似性，同時(shí)與 Ras 蛋白具有較高同源性，又稱為 Ras 超家族，分為 Ras、Rho、Arf、Sar、Ran、Rab 六個(gè)亞家族，參與多種信號(hào)傳遞途徑。其中 Ras 蛋白是細(xì)胞增殖與分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其基因的突變與許多人類腫瘤有關(guān)。2、大分子

9、 G 蛋白（鳥苷酸結(jié)合蛋白（guanine nucleotide binding protein，簡稱 G 蛋白） ）：G 蛋白是一類和 GTP 或 GDP 相結(jié)合、位于細(xì)胞膜胞漿面的外周蛋白，由三個(gè)亞基組成。他們是 α 亞基（45KD） 、β 亞基（35KD）和 γ 亞基（7KD） 。G 蛋白有兩種構(gòu)象，一種以 αβγ 三聚體存在并與 GDP結(jié)合，為非活化型；另一種構(gòu)象是 α 亞基與 GTP 結(jié)合并導(dǎo)致 βγ 二聚體的脫落，此型為活化

10、型。功能：1、調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶活性；2、調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜 cGMP 磷酸二酯酶活性。3、調(diào)節(jié)磷脂酶 C 活性，促進(jìn) IP3與 DG 的生成；4、調(diào)節(jié)離子通道。類似機(jī)制至少出現(xiàn)在六個(gè) E. coli 操縱子中，它們編碼的酶均參與 Aa 的合成。13、DNA 的體外重組：DNA 的體外重組是指含有特異目的基因的 DNA 片段與載體 DNA 在試管內(nèi)連接的過程。常用的方法：1、粘性末端連接法；2、平末端連接法；3、結(jié)尾法；4、人工接頭法（linke

11、r） 。14、 “自殺基因”的基因治療：也稱活化前體藥物性基因治療。某些病毒或細(xì)菌產(chǎn)生的酶能將對人體無毒或低毒的藥物前體，在人體細(xì)胞內(nèi)一系列酶的催化下轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒性物質(zhì)，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。15、限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endonuclease）：是一類特異性地水解雙鏈（ds）的 DNA 的磷酸二酯酶。分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。內(nèi)切酶的用途：1、制作 DNA 物理圖譜；2、DNA 限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLPS） 。3、基因

12、克隆及亞克?。?、DNA 雜交與序列分析；5、基因組同源性研究；6、基因突變和化學(xué)修飾的研究。16、感受態(tài)細(xì)胞（copetent cell）：理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞，使其處于最適攝取和容納外來 DNA 的生理狀態(tài)。17、單順反子（monocistron）：真核基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子，即一個(gè)基因編碼一條多肽鏈或 RNA鏈，每個(gè)基因轉(zhuǎn)錄有各自的調(diào)節(jié)元件。18、包裝細(xì)胞（pakaging cell）：包裝細(xì)胞是通過基因工程技術(shù)對細(xì)胞進(jìn)行修飾，使其產(chǎn)

13、生病毒結(jié)構(gòu)基因 gag、pol、env 所編碼的蛋白，為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝成為重組病毒提供全面的病毒蛋白，同時(shí)，該包裝細(xì)胞并不能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生編碼完整病毒的基因組 RNA，一句話，包裝細(xì)胞本身不能產(chǎn)生任何形式的病毒顆粒。19、基因敲除(gene knockout)：將細(xì)胞基因組的某一序列克隆并加以改造后重新導(dǎo)入細(xì)胞中，這一序列就可以與基因組內(nèi)的同源序列發(fā)生重組，從而將改造后的基因置換到基因組內(nèi)，實(shí)現(xiàn)基因的定位突變?？梢杂谜；蚯贸蛔兊幕?/p>

14、，以進(jìn)行性狀的改良和遺傳病的治療，又可以用突變的基因敲除正常的基因，以研究此基因在發(fā)育和調(diào)控方面的作用。Gene knockout，基因敲除，定向敲除，基因敲除小鼠。Gene knockin，基因敲入，定向替代，插入到無關(guān)基因的地方，基因整合，基因重組小鼠。20、基因打靶（gene targeting）：有些生物，例如釀酒酵母，通過轉(zhuǎn)化后細(xì)胞中發(fā)生的外源 DNA 與核基因組 DNA 之間的同源重組，可使外源基因插入到特定的染色體位置，此

15、過程叫基因打靶，有時(shí)也叫基因置換（transplacement） 。應(yīng)用此技術(shù)，我們能夠?qū)Ⅲw外修飾改造的突變基因或是某種新的基因，取代特定的染色體基因，從而在生物活體內(nèi)研究此基因的功能。21、RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism， RFLP）限制性片段長度多態(tài)性，人類第一代遺傳標(biāo)記。當(dāng)用限制性內(nèi)切酶切割不同品種或個(gè)體的基因組 DNA 時(shí)，如果限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的堿基發(fā)生突變，或者

16、酶切位點(diǎn)之間 DNA 片段發(fā)生堿基的插入或缺失，導(dǎo)致酶切片斷的大小、數(shù)量發(fā)生了變化，產(chǎn)生相當(dāng)多的數(shù)目和大小不等的 DNA 片段。這種變化可以通過特定的探針雜交進(jìn)行檢測，從而可以比較不同品種或個(gè)體之間的 DNA 水平的差異（或多態(tài)性）。廣泛用于基因組遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位以及生物的進(jìn)化和分類關(guān)系研究。22、RAPD（Random Amplified Polymorphism DNA， RAPD）隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA，利用隨即引物擴(kuò)增尋找

17、多態(tài)性 DNA 片段的分子標(biāo)記方法。是建立在 PCR 技術(shù)基礎(chǔ)上，利用一系列（通常數(shù)百）不同的隨機(jī)排列堿基順序的寡聚核苷酸單鏈（一般為 10bp）為引物，對所研究的基因組 DNA 進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，然后用凝膠電泳分開擴(kuò)增片段，EB 等染色劑染色后檢測擴(kuò)增產(chǎn)物 DNA 片段的多態(tài)性。與 RAPD技術(shù)相類似的還有 AP-PCR（Arbitrary Primed PCR，任意引物 PCR）和 DAF（DNA Amplified Fingerp

18、rints）2 種標(biāo)記技術(shù)。在 AP-PCR 分析中，引物長度與常規(guī) PCR 相當(dāng)，但退火溫度較低，允許大量錯(cuò)配，引發(fā)具有隨機(jī)性質(zhì)的擴(kuò)增。所使用的引物較長（通常 10～50bp），擴(kuò)增分為 3 個(gè)部分，每個(gè)部分要求的條件和組分的濃度存在差異。DAF 是一種改進(jìn)的 RAPD 分析技術(shù)，與 RAPD 技術(shù)不同的是它使用引物濃度更高，長度更短（一般 5～8bp），只有 2 個(gè)溫度循環(huán)，并常用聚丙烯酰胺凝膠電泳，所提供譜帶信息比 RAPD 大得

19、多。三者合稱任意擴(kuò)增多帶譜。23、AFLP（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）擴(kuò)增片段長度多態(tài)性，AFLP 是RFLP 和 PCR 結(jié)合的產(chǎn)物，其基本原理是：將基因組 DNA 進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切，然后選擇特定的片段進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，使用雙鏈人工“接頭”與基因組 DNA 的酶切片段相連接作為擴(kuò)增反應(yīng)模板，“接頭”與“接頭”相鄰的酶切片段的幾個(gè)堿基序列作為引物的結(jié)合位點(diǎn)。這樣就只有那