中國近海典型赤潮生物細(xì)胞表面蛋白質(zhì)組研究.pdf

1、東海原甲藻（Procentrum donghaiense Lu）和鏈狀亞歷山大藻（Alexandrium catenella）是中國近海兩種重要的有害赤潮生物，常形成大規(guī)模的赤潮，已對海洋生態(tài)系統(tǒng)、沿海養(yǎng)殖業(yè)和人民健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。本研究以這兩種赤潮生物為模式種，運用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)、現(xiàn)代蛋白質(zhì)組技術(shù)、免疫蛋白質(zhì)組技術(shù)和生物質(zhì)譜技術(shù)等研究了這兩種赤潮生物細(xì)胞表面蛋白質(zhì)組，制備了高特異性細(xì)胞表面抗體，分離、確認(rèn)了細(xì)胞表面蛋白，并對細(xì)胞表

2、面蛋白進行了鑒定，初步研究了赤潮生物細(xì)胞表面蛋白質(zhì)組對環(huán)境中氮營養(yǎng)變動的響應(yīng)。取得了以下主要成果： 1．制備了用于識別赤潮生物細(xì)胞表面蛋白的抗體血清：0．5％多聚甲醛（PFA）固定抗原制備的全細(xì)胞表面蛋白的抗體血清滴度分別為鏈狀亞歷山大藻1：2000，東海原甲藻1：5000；建立并優(yōu)化了免疫熒光檢測細(xì)胞表面蛋白的檢測方法，表明東海原甲藻的抗體血清具有較強的種間特異性，不與同屬其它藻株和其他浮游植物的細(xì)胞表面抗原發(fā)生交叉反應(yīng)；亞

3、歷山大藻細(xì)胞細(xì)胞表面抗體血清與其同屬的藻細(xì)胞表面抗原發(fā)生交叉反應(yīng)； 2．結(jié)合細(xì)胞表面免疫標(biāo)志熒光技術(shù)和免疫蛋白質(zhì)組技術(shù)分離、確認(rèn)了兩種赤潮生物細(xì)胞表面蛋白，并運用生物質(zhì)譜技術(shù)對細(xì)胞表面蛋白進行了鑒定。免疫熒光結(jié)果表明，制備的抗體具有高特異性，只識別相應(yīng)藻的細(xì)胞表面蛋白而不與細(xì)胞膜上和細(xì)胞內(nèi)蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)；通過蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)和Western blot技術(shù)分離、確認(rèn)東海原甲藻細(xì)胞表面蛋白58個，鏈狀亞歷山大藻細(xì)胞表面蛋白12

4、3個，分別占提取的細(xì)胞壁蛋白的19．1％和67．6％；運用MALDI—TOF—TOF MS技術(shù)對鏈狀亞歷山大藻45個細(xì)胞表面蛋白進行鑒定，其中12個蛋白是與營養(yǎng)吸收和轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白，10個蛋白是與鞭毛相關(guān)的運動性蛋白，4個蛋白為細(xì)胞壁修飾酶；3個蛋白為信號傳導(dǎo)蛋白；2個蛋白為抵御病害的抗壓蛋白以及其它功能蛋白14個； 3．應(yīng)用蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)比較研究了不同氮營養(yǎng)條件下鏈狀亞歷山大藻細(xì)胞壁蛋白質(zhì)組的差異表達。結(jié)果表明，相比硝酸鹽

5、培養(yǎng)條件下的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)組，尿素培養(yǎng)條件下出現(xiàn)了兩個明顯的新蛋白質(zhì)點（ACUR1和ACUR2），銨鹽條件下出現(xiàn)了一組新蛋白ACNHg1和一個新蛋白質(zhì)點ACNH1；氮限制條件下，雖然細(xì)胞表面蛋白的總量和蛋白點數(shù)明顯減少，但也出現(xiàn)了一些新的蛋白質(zhì)點（ACLN1、ACLN2、ACLN3、ACLN4、ACLN5和ACLN6）。這些新出現(xiàn)的蛋白質(zhì)點反映了藻細(xì)胞表面對營養(yǎng)變動的一種響應(yīng)，可將這些新出現(xiàn)的蛋白點作為細(xì)胞對環(huán)境營養(yǎng)物質(zhì)變動的一種生物標(biāo)