中國(guó)近海典型赤潮生物種間及生理指示生物標(biāo)志物研究.pdf

1、東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense Lu)和鏈狀亞歷山大藻(Alexandrium catenella)是我國(guó)近海兩種主要有害赤潮生物，在東南沿海常形成大規(guī)模的赤潮，已對(duì)近海生態(tài)系統(tǒng)、沿海養(yǎng)殖業(yè)、人民健康和生命財(cái)產(chǎn)安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。 本論文以這兩種赤潮生物為模式種，引入現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)概念及技術(shù)，比較了四種蛋白質(zhì)提取方法，建立了用于赤潮生物蛋白質(zhì)組學(xué)研究的總蛋白質(zhì)提取方法：研究了兩種亞歷山大藻蛋白質(zhì)組

2、的差異，確認(rèn)了種間特異性指示蛋白；比較研究了不同生長(zhǎng)期和生長(zhǎng)條件下，赤潮生物蛋白質(zhì)組的差異表達(dá)，確認(rèn)、鑒定了一批特異性生理指示生物標(biāo)志物，探討了它們?cè)诔喑鄙锷顒?dòng)及赤潮形成中的作用。取得的主要結(jié)果如下： 1．建立和優(yōu)化了用于赤潮生物蛋白質(zhì)組學(xué)研究的總蛋白提取方法。比較研究了四種蛋白質(zhì)提取方法：曲拉通100—尿素提取法、三氯乙酸—丙酮沉淀法、40mMTris—5％甘油提取法和40mMTris提取法的蛋白提取效果。結(jié)果表明，曲

3、拉通100—尿素提取法的蛋白提取效果最好，蛋白點(diǎn)分離清晰，蛋白點(diǎn)數(shù)多(可達(dá)上千點(diǎn))，而且未造成堿性蛋白和高分子量蛋白的丟失。該方法提取過(guò)程簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，為開展赤潮藻生物蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了一種高效、簡(jiǎn)便的方法； 2．結(jié)合形態(tài)分類學(xué)和分子生物學(xué)方法，比較研究了我國(guó)近海兩種主要赤潮生物塔瑪亞歷山大藻A．tamarense DH01和鏈狀亞歷山大藻A．catenella DH01蛋白質(zhì)組的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)它們的蛋白2—DE圖譜相似性

4、達(dá)99％，在分類上，這兩種亞歷山大藻應(yīng)屬于同一種藻。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了一些特異性表達(dá)蛋白，如A．tamarense DH01中的AT1—5，A．catenella DH01中的AC1—3，它們可作為種內(nèi)鑒定的一類特異性生物標(biāo)志物； 3．比較研究了不同生長(zhǎng)時(shí)期東海原甲藻和鏈狀亞歷山大藻蛋白質(zhì)組的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了一些與細(xì)胞生長(zhǎng)周期相關(guān)的生物標(biāo)志物：在東海原甲藻中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的cdc2蛋白激酶1，該蛋白在指數(shù)生長(zhǎng)期的藻細(xì)胞

5、中表達(dá)明顯，在消亡期表達(dá)量明顯下降，一些蛋白，如17—19號(hào)(RubisCo)，21、23-26、28、30號(hào)，在消亡期幾乎不表達(dá)；在鏈狀亞歷山大藻種也發(fā)現(xiàn)了多個(gè)蛋白，31—35，46—48、61—70號(hào)蛋白在消亡期表達(dá)量明顯下降。這些蛋白可作為指示細(xì)胞不同生長(zhǎng)期的一類潛在的特異性生物標(biāo)志物； 4．比較不同營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)下的細(xì)胞蛋白質(zhì)組的差異表達(dá)發(fā)現(xiàn)，在氮或磷限制的條件下，東海原甲藻細(xì)胞中的一些蛋白，如PC1、PC3、PC5和PC7

6、—9不表達(dá)，而一組酸性蛋白，PC2表達(dá)明顯增加，這些蛋白可作為指示氮或磷限制的生物標(biāo)志物；而一些蛋白僅在氮限制時(shí)表達(dá)明顯減弱(PC4、PC6)或不表達(dá)(PP1—3)，這些蛋白可作為指示氮限制的生物標(biāo)志物：在鏈狀亞歷山大藻中也發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與氮限制相關(guān)的蛋白AN1：一些蛋白，如AN1—5、AP1和AC1在添加氮或磷后表達(dá)明顯增強(qiáng)，并在藻細(xì)胞處于良好生長(zhǎng)狀態(tài)時(shí)也有很強(qiáng)的表達(dá)，這些蛋白可作為指示藻細(xì)胞處于良好營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的生物標(biāo)志物； 5．