花生arachishypogaeal.球蛋白基因cdna的克隆及其表達(dá)研究

1、山東師范大學(xué)碩士學(xué)位論文花生（Arachis hypogaea L.）球蛋白基因cDNA的克隆及其表達(dá)研究姓名：楊輝霞申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：發(fā)育生物學(xué)指導(dǎo)教師：畢玉平20040428花生f A r a c h l sh y p o g a e aL ．J 球蛋白基因e D N A 曲克小反其表迭葉究花生( A r a c h i sh y p o g a e aL ．) 球蛋白基因e D N A的克隆及其表達(dá)研究摘要豆類植物種子貯藏蛋

2、白是人類膳食蛋白的三大來源之一，對于動物蛋白來源供應(yīng)不足的發(fā)展中國家尤為重要。但是大多數(shù)豆類貯藏蛋白缺乏某些人類必需氨基酸，尤其是含硫氨基酸蛋氨酸和半胱氨酸；另外，已鑒定的一些植物過敏原也屬于豆類貯藏蛋白。因此，豆類貯藏蛋白品質(zhì)亟待改良。通過基因工程手段改良蛋白品質(zhì)，提高必需氨基酸的含量，降低其過敏原性已被證明是一種有效的手段。為克隆花生貯藏蛋白基因我們建立了花生未成熟種子的e D N A 文庫。根據(jù)大豆球蛋白基因的保守區(qū)設(shè)計特異引物，

3、從花生e D N A 文庫中擴(kuò)增出4 6 2 b p 的特異性片段。將該片段克隆到p G E M ．T 載體上，測序分析證明它與大豆球蛋白各亞基基因的同源性達(dá)9 0 ％以上，與花生球蛋白基因A r a h 4 的同源性為9 4 ％，說明該片段就是花生球蛋白基因的片段。以該片段作探針采用噬菌體原位雜交法從上述e D N A 文庫中篩選到一個陽性克隆，用P C R 方法擴(kuò)增插入片段并亞克隆到p G E M ．T 載體上，測序分析證明其為包含

4、1 8 8 6 個核苷酸的一個開放閱讀框，編碼5 3 6 個氨基酸。進(jìn)一步分析表明該c D N A編碼的多肽鏈經(jīng)過翻譯后加工成為成熟的酸性亞基和堿性亞基，這與大豆球蛋白和豌豆球蛋白的合成過程類似。推定的氨基酸序列包含兩個保守的“c u p i n ”緒構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域?qū)τ诨ㄉ虻鞍椎倪^敏原性、耐熱性以及抗蛋白酶消化等功能均具有重要意義。通過N o r t h e r n 印跡雜交初步研究了花生球蛋白基因的表達(dá)模式。在種子發(fā)育的第一個階段就

5、有球蛋白基因的微量表達(dá)，在后三個階段表達(dá)量一直持續(xù)很高。但在花生葉片和種皮中沒有檢測到球蛋白基因的表達(dá)，表明花生球蛋白基因的表達(dá)受發(fā)育階段的調(diào)控并具有組織特異性，與其它豆類植物的球蛋白類似，調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上。我國的花生產(chǎn)量居世界首位，山東省又是花生的主要產(chǎn)區(qū)，但目前花生優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源匱乏，通過基因工程手段改良花生品質(zhì)前景廣闊。本實驗室構(gòu)建了花生未成熟種子的e D N A 文庫并篩選到一個新的花生球蛋白基因的c D N A 全長序列