兩例無出血癥狀凝血因子v缺陷癥患者分子發(fā)病機制研究

1、溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文兩例無出血癥狀凝血因子V缺陷癥患者分子發(fā)病機制研究姓名：牛真珍申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：臨床檢驗診斷學(xué)指導(dǎo)教師：王明山201105溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文二、樣本的采集和處理在征得患者及家系成員知情同意后，采集家系成員靜脈血，1 0 9 m m o l ／L 枸櫞酸三鈉1 ：9 抗凝，4 ℃3 0 0 0 r ／m i n 離心1 5 m i n ，取乏血小板血漿，分裝，一7 0 。C保存。D N A 提取試劑盒抽提家

2、系所有成員外周血細胞基因組D N A ，一7 0 。C 保存待用。三、F V 表型檢測1 、S T A G 滬S T A —R 全自動血凝儀檢測P T 、A P T T 、F I I 活性( F l I ：C ) 、F V ：C 、F Ⅶ活性( F V I I ：C ) 、F X 活性( F X ：C ) 。 因子活性檢測采用一期凝固法，試劑盒由法國S T A G O 公司配套提供。所有操作步驟均嚴格按照試劑說明書進行。2 、F V 抗

3、原( F V ：A g ) 檢測：采用E L I S A 法( 由上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院完成) 。四、F V 基因分析根據(jù)F V 基因序列( G e n B a n kA Y 3 6 4 5 3 5 ) ，應(yīng)用p r i m e r 5 ．0 軟件共設(shè)計3 0 對引物以覆蓋F V 基因的所有外顯子區(qū)域及其側(cè)翼序列。P C R 反應(yīng)在擴增儀( A B IT h e r m l c y c l e r2 7 2 0 ，U S A ) 上進

4、行，P C R 產(chǎn)物送上海桑尼生物科技有限公司，膠純化回收制備模板，采用雙脫氧鏈終止法在3 7 3 0 X LA B I 測序儀上進行測序，用C h r o m a s 軟件將測序結(jié)果與美國基因庫( N C B l ) 所公布的A Y 3 6 4 5 3 5 序列進行在線比對( B l a s t e r ) ，以尋找基因變異。結(jié)果一、F V 表型檢測結(jié)果兩家系先證者P T 、A P T T 均顯著延長，患者1 分別為3 1 ．5s 和

5、1 0 4 ．1 S ；患者2 分別為2 3 ．6 s 和7 5 ．9 s ?；颊?F V ：C 為4 ％，F(xiàn) V ：A g 為2 ．6 2 ％；患者2 F V ：C為5 ％，F(xiàn) V ：A g 為1 8 ．4 6 ％，兩者均顯著減低。兩家系其他成員P T 和A P T T 基本在正常參考范圍內(nèi)。除家系1 外孫女Ⅳ2 和家系2 二姐1 12 外，其他家系成員F V ：C水平和F V ：A g 含量均有不同程度降低。二、F V 基因檢測結(jié)果

6、兩個家系F V 基因篩查共發(fā)現(xiàn)2 8 個點突變，均為單核苷酸多態(tài)性( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m S N P ) 位點，未發(fā)現(xiàn)新的基因突變。1 、家系l ：在先證者及家系成員的1 3 、1 5 和1 6 號外顯子共發(fā)現(xiàn)1 2 個S N P 位點，包括6 個同義突變位點和6 個錯義突變位點，其中B 結(jié)構(gòu)域1 0 個，A 3 結(jié)構(gòu)域2 個。2 、家系2 ：在先證