兩例無(wú)出血癥狀凝血因子V缺陷癥患者分子發(fā)病機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　 遺傳性凝血因子V(FV)缺陷癥又稱Owren病或副血友病，是一種罕見(jiàn)的常染色體隱性遺傳性出血性疾病，在人群中的發(fā)病率約為1/1000，000，男女均可罹患。由于其發(fā)病率低以及FV基因的復(fù)雜性，分子發(fā)病機(jī)制研究目前仍較少。FV又稱為前加速素或易變因子，是由凝血酶原酶復(fù)合物催化快速生成凝血酶所必需的蛋白輔因子，對(duì)維持出凝血平衡起著重要作用。FV缺陷癥患者出血程度輕重不等，出血癥狀大多發(fā)生于6歲以前，以鼻衄、口腔黏膜出血

2、、女性月經(jīng)量過(guò)多、外傷和術(shù)后出血相對(duì)常見(jiàn)。FV缺陷通常表現(xiàn)為促凝功能下降，F(xiàn)V促凝活性(FV：C)降低，血漿凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)顯著延長(zhǎng)。目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道的FV缺陷癥患者均為散發(fā)，且大多有自發(fā)性或繼發(fā)性出血史。本研究通過(guò)對(duì)兩例無(wú)出血癥狀的FV缺陷癥患者及其家系進(jìn)行FV表型分析和FV基因篩查，旨在探討無(wú)出血癥狀凝血因子V缺陷癥的分子發(fā)病機(jī)制。
　　 方法:
　　 一、研究對(duì)象
　　

3、1、家系1：先證者，女，62歲，溫州文成人。育有4子女，曾行輸卵管結(jié)扎術(shù)，自訴無(wú)出血病史。先證者因做白內(nèi)障手術(shù)來(lái)診，術(shù)前行凝血常規(guī)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PT31.5s/13.0s～14.2s，APTT104.1s/31.2s～40.6s，兩者均顯著延長(zhǎng)，患者無(wú)肝腎功能障礙。進(jìn)一步做凝血因子活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)FV：C為4％，明顯下降。家系其他成員均無(wú)出血史，先證者父母非近親婚配。
　　 2、家系2：先證者，女，41歲，溫州蒼南人，于2009年12月

4、在蒼南人民醫(yī)院做翼狀胬肉切除術(shù)，術(shù)后愈合良好，無(wú)出血事件發(fā)生。術(shù)后，先證者于2010年1月來(lái)我院復(fù)查，凝血常規(guī)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PT23.6s/13.0s～14.2s，APTT75.9s/31.2s～40.6s，兩者均顯著延長(zhǎng)，患者無(wú)肝腎功能障礙。進(jìn)一步做凝血因子活性篩查，發(fā)現(xiàn)FV：C為5％，明顯下降。此后，先證者于2010年2月發(fā)生車禍，踝骨處軟組織外傷，行外科縫合術(shù)，共6針，8天拆線，傷口愈合良好。家系其他成員均無(wú)出血史，先證者父母非近親婚配

5、。
　　 3、正常對(duì)照：100例，男57例，女43例，平均年齡35(22～67)歲，均為我院健康體檢者。對(duì)照組經(jīng)查均無(wú)肝腎功能疾病，無(wú)血栓或出血史，采樣前已征得本人同意。
　　 二、樣本的采集和處理
　　 在征得患者及家系成員知情同意后，采集家系成員靜脈血，109mmol/L枸櫞酸三鈉1：9抗凝，4℃3000r/min離心15min，取乏血小板血漿，分裝，-70℃保存。DNA提取試劑盒抽提家系所有成員外周血細(xì)胞基

6、因組DNA，-70℃保存待用。
　　 三、FV表型檢測(cè)
　　 1、STAGO-STA-R全自動(dòng)血凝儀檢測(cè)PT、APTT、FⅡ活性(FⅡ：C)、FV：C、FⅦ活性(FⅦ：C)、FX活性(FX：C)。因子活性檢測(cè)采用一期凝固法，試劑盒由法國(guó)STAGO公司配套提供。所有操作步驟均嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
　　 2、FV抗原(FV：Ag)檢測(cè)：采用ELISA法(由上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院完成)。
　　 四、FV基

7、因分析
　　 根據(jù)FV基因序列(GenBankAY364535)，應(yīng)用primer5.0軟件共設(shè)計(jì)30對(duì)引物以覆蓋FV基因的所有外顯子區(qū)域及其側(cè)翼序列。PCR反應(yīng)在擴(kuò)增儀(ABIThermlcycler2720，USA)上進(jìn)行，PCR產(chǎn)物送上海桑尼生物科技有限公司，膠純化回收制備模板，采用雙脫氧鏈終止法在3730XLABI測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序，用Chromas軟件將測(cè)序結(jié)果與美國(guó)基因庫(kù)(NCBl)所公布的AY364535序列進(jìn)行在線

8、比對(duì)(Blaster)，以尋找基因變異。
　　 結(jié)果:
　　 一、FV表型檢測(cè)結(jié)果
　　 兩家系先證者PT、APTT均顯著延長(zhǎng)，患者1分別為31.5s和104.1s；患者2分別為23.6s和75.9s?；颊?FV：C為4％，F(xiàn)V：Ag為2.62％；患者2FV:C為5％，F(xiàn)V：Ag為18.46％，兩者均顯著減低。兩家系其他成員PT和APTT基本在正常參考范圍內(nèi)。除家系1外孫女Ⅳ2和家系2二姐112外，其他家系成員F

9、V：C水平和FV:Ag含量均有不同程度降低。
　　 二、FV基因檢測(cè)結(jié)果
　　 兩個(gè)家系FV基因篩查共發(fā)現(xiàn)28個(gè)點(diǎn)突變，均為單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphismSNP)位點(diǎn)，未發(fā)現(xiàn)新的基因突變。
　　 1、家系1：
　　 在先證者及家系成員的13、15和16號(hào)外顯子共發(fā)現(xiàn)12個(gè)SNP位點(diǎn)，包括6個(gè)同義突變位點(diǎn)和6個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)，其中B結(jié)構(gòu)域10個(gè)，A3結(jié)構(gòu)域2個(gè)。

10、>　　 2、家系2：
　　 在先證者及家系成員的外顯子4、8、9、11、12、13、15、16和25共發(fā)現(xiàn)16個(gè)SNP位點(diǎn)，包括8個(gè)同義突變位點(diǎn)和8個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)，其中A1結(jié)構(gòu)域2個(gè)，A2結(jié)構(gòu)域5個(gè)，B結(jié)構(gòu)域6個(gè)，A3結(jié)構(gòu)域2個(gè)，C2結(jié)構(gòu)域1個(gè)。
　　 3、兩個(gè)家系共同的SNP位點(diǎn)有8個(gè)，如下：p．717Asn(g.45550A＞G)，p．Lys830Arg，p.His837Arg,p.Lys897Glu,p.1240

11、Ser(g.47153G＞T),p.Pro1376Ser,p.1646Gly(g.57433T＞C),p.Met1736Val。
　　 結(jié)論:
　　 1、通過(guò)對(duì)兩個(gè)家系FV基因篩查共發(fā)現(xiàn)28個(gè)點(diǎn)突變，均為單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，未發(fā)現(xiàn)新的基因突變。
　　 2、FV活性的下降程度并不是決定FV缺陷患者臨床癥狀輕重的唯一因素，F(xiàn)V的表型和基因型沒(méi)有很好的一致性。
　　 3、本研究中兩例FV缺陷癥患者的無(wú)出血癥狀可